生物制藥純化工藝開發(fā)了純化工藝方案以純化治療用單克隆抗體。經(jīng)典的抗體純化方法是使用Protein A親和層析大量捕獲細(xì)胞上清中的抗體之后，再使用其他層析方法去除抗體中的雜質(zhì)。現(xiàn)在，我們給大家提出另一種方案，這種方案不使用親和層析這一經(jīng)典步驟，它使用了兩根可互換的色譜步驟和非親和性層析方法。這種純化方案包括陽離子交換柱（CEX）和疏水電荷誘導(dǎo)（HCI）柱，并且無需進(jìn)行過程中的過濾步驟。由于HCl層析介質(zhì)具有去除各種不確定雜質(zhì)的能力，因此該方案的病毒清除效率很高。該方案的規(guī)?？梢员冉?jīng)典方法擴(kuò)大1000到10000倍，并且保持各種抗體的平均總回收率＞70％。此純化工藝過程中污染物的去除和產(chǎn)品質(zhì)量與經(jīng)典的親和三步層析方法的相關(guān)雜質(zhì)、產(chǎn)品質(zhì)量相當(dāng)。

蛋白質(zhì)大規(guī)模純化的經(jīng)濟(jì)性很重要，特別是對于治療用抗體，治療用抗體的使用量相對于其他生物制品來說是比較大的，一般都在100mg左右的級別?？贵w占市場上治療性生物制劑的很大比例，約占重組蛋白產(chǎn)品銷售總額的30％?；诳贵w療法相關(guān)的純化成本往往特別高，因?yàn)榧兓情_發(fā)，生產(chǎn)需要許多昂貴的層析介質(zhì)。通常，抗體每劑需要較高的劑量，純化方案對最終產(chǎn)品質(zhì)量和工藝經(jīng)濟(jì)性都非常重要，因?yàn)閮H純化就可占下游加工成本的三分之二。當(dāng)產(chǎn)品是單克隆抗體時(shí)，親和捕獲層析柱（如蛋白質(zhì)A）的介質(zhì)成本可能會超過其他原材料的成本。

盡管開發(fā)了在高流速情況下，層析介質(zhì)的載量也有所提高的改進(jìn)性能的高級層析介質(zhì)，親和層析法通常仍被用作捕獲步驟，以滿足純度、產(chǎn)率和載量的要求。傳統(tǒng)上，基于親和層析的捕獲步驟（蛋白質(zhì)A或G）之后是至少一個(gè)或兩個(gè)其他層析步驟。另外，需要一個(gè)或多個(gè)過程中的過濾步驟，將制品進(jìn)行各種處理（調(diào)酸堿、過濾、超濾等）才能進(jìn)行下一步的層析步驟。蛋白質(zhì)A層析不僅比非親和介質(zhì)貴至少四到五倍，而且還可能存在蛋白A配體的脫落等問題。通常，即使使用親和層析法，除非穿插了一個(gè)或多個(gè)精純步驟，通常也無法獲得足夠純度和好的病毒清除率。


通過消除下游加工中的特定步驟，可以在保持分子完整性和純度的同時(shí)最大化生產(chǎn)率。我們描述了一種靈活，可互換，非親和的兩步純化方法，由于其簡單性和涉及的純化步驟數(shù)少，與基于親和層析的方案相比，該方法可以以較低的成本實(shí)現(xiàn)，總體回收率高，最終產(chǎn)品質(zhì)量等同于傳統(tǒng)三步層析的方法。


我們不僅減少了純化過程的步驟數(shù)量，而且消除了對過程中濃縮或過濾的需求（這意味著更多的開發(fā)、優(yōu)化、放大、清潔和清潔驗(yàn)證以及增加的過程）成本，同時(shí)也避免了在純化過程中潛在的損失和產(chǎn)品質(zhì)量變化的風(fēng)險(xiǎn)。減少純化步驟數(shù)量將減少過程組件、緩沖液、儲液罐和其他設(shè)備的數(shù)量。最后，兩步純化過程可以很容易地用于許多抗體分子的臨床生產(chǎn)中，而對開發(fā)成本，時(shí)間和資源需求的投入?yún)s相對比較少。

兩步純化過程

兩步純化過程研究了兩種不同的層析介質(zhì)，陽離子交換（CEX）介質(zhì)和疏水電荷誘導(dǎo)（HCI）層析介質(zhì)，兩種分離純化介質(zhì)組合使用。純化的方案可適應(yīng)不同的細(xì)胞上清、抗體種類和用戶的選擇，同時(shí)仍將宿主細(xì)胞蛋白（HCP），病毒顆粒，核酸，產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和培養(yǎng)基添加劑（例如甲氨蝶呤，胰島素，維生素）清除到一定水平可用于最終的治療用途。

兩步層析過程具有高度的靈活性，因?yàn)閷游鼋橘|(zhì)可以雙向流動，CEX和HCl介質(zhì)都可用于捕獲或精純步驟，而無需進(jìn)行過程內(nèi)切向流過濾（超濾，TFF）。使用CEX色譜進(jìn)行捕獲可利用人類抗體的較高pI（通常高于8），從而可以在接近中性的pH值下捕獲或結(jié)合它們（例如在pH值6.2條件下）。如果負(fù)載的pH值保持在中性附近或以上時(shí)，則HCl介質(zhì)可適應(yīng)各種電導(dǎo)率值。病毒滅活步驟可以在層析步驟之間或在第二次層析之后進(jìn)行。進(jìn)行病毒過濾的時(shí)候是在純化過程結(jié)束之后，產(chǎn)品配制之前，這樣對于除病毒過濾的體積更小，更易于管理，而且這個(gè)時(shí)候產(chǎn)品已完成了全部的純化步驟。

現(xiàn)今，先進(jìn)的各種層析填料所具有的獨(dú)特性能使純化工藝的簡化（三步變?yōu)閮刹剑┏蔀榭赡?。例如，疏水層析填料，一種基于HCI的層析介質(zhì)，取決于結(jié)合的pH（中性及以上），但與電導(dǎo)率（最高1M的NaCl溶液）無關(guān)。這就是它使用極其靈活的原因。當(dāng)使用疏水層析填料進(jìn)行捕獲時(shí)，介質(zhì)對細(xì)胞培養(yǎng)上清液的高電導(dǎo)率不敏感，從而可以直接將細(xì)胞上清上樣進(jìn)行收獲。還有，在收獲抗體期間對細(xì)胞上清進(jìn)行預(yù)調(diào)節(jié)可延長層析介質(zhì)作為捕獲步驟的使用壽命。

當(dāng)進(jìn)行抗體的洗脫時(shí)，疏水層析對上樣過程中寬范的電導(dǎo)率耐受性特別有用。因此，由于疏水樹層析介質(zhì)可用于捕獲或精純，因此在建議的純化方案中應(yīng)該具有互換性。

在洗脫過程中可以看到疏水層析介質(zhì)提供的另一個(gè)好處是，隨著pH的降低，由于配體與抗體之間的靜電排斥作用，產(chǎn)物得以回收，電導(dǎo)率在洗脫過程中沒有重大影響。因此，當(dāng)使用疏水層析介質(zhì)進(jìn)行捕獲時(shí)，洗脫液可以使用低電導(dǎo)率收集，這樣做的好處是第一步收集的制品不用進(jìn)行任何的處理，就可以有效的結(jié)合到下一步的CEX層析柱上。因此，產(chǎn)品可以直接從HCI柱流到CEX柱，而無需任何過程中的超濾（TFF）。如果將疏水層析作為精純步驟，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率則具有更大的靈活性，因?yàn)镠Cl是最后的層析步驟。此外，疏水層析可被視為TFF的替代層析步驟。

疏水層析的優(yōu)化

對HCI層析方法進(jìn)行了多項(xiàng)研究，以最大程度地減少洗脫過程中的HCP含量。在捕獲層析方法研究中，將洗脫過程中的電導(dǎo)率降低以及將洗脫pH從3-4提高到4.8-5.2有利于以最小的HCP相對量優(yōu)先洗脫目標(biāo)產(chǎn)物（下圖）。 此外，我們通過降低洗脫流速實(shí)現(xiàn)了更高的純度（下圖）。
其他參數(shù)，例如低電導(dǎo)率洗脫和用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行淋洗，也有助于從純化的抗體中去除HCP。

最后，我們觀察到疏水層析的結(jié)合能力不僅可以通過目標(biāo)產(chǎn)物在色譜柱中的停留時(shí)間來控制，還可以通過在平衡和上樣期間操縱緩沖液種類來控制。例如，當(dāng)基于磷酸鹽的緩沖液的強(qiáng)度從35mM降低到10mM時(shí)，特異性抗體的結(jié)合能力從13mg/mL增加到22mg/mL，增加了約70％。

下面我們看一個(gè)示例，來進(jìn)一步了解疏水層析：

1 細(xì)胞上清收獲和處理

收集含有單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用35或70mM磷酸鈉緩沖液（pH 6.2）進(jìn)行細(xì)胞上清的收集。對于將疏水層析用作捕獲層析的實(shí)驗(yàn)，在上樣之前將樣品調(diào)節(jié)至中性pH值。

2 層析填料的選擇

抗體將以15至45mg/mL的結(jié)合能力加載到CEX層析介質(zhì)上。但是，如果使用載量更高的層析填料，有些層析填料的載量值可以進(jìn)一步提高到超過100mg/mL。將產(chǎn)物在pH6.2下加入40至75mM NaCl緩沖液分步洗脫。疏水層析填料，平衡使用10、35或70 mM磷酸鈉（pH 7.0至7.2），產(chǎn)品載量最大為22mg/mL。填料用10到45mM磷酸鈉（pH 6.2到7.0）進(jìn)行上樣后淋洗，然后在用低電導(dǎo)率緩沖液洗脫。當(dāng)使用pH范圍為4.5-5.2的緩沖液時(shí)，使用另一種低電導(dǎo)率的緩沖液（例如10 mM乙酸鈉或乙酸鹽和磷酸鹽雙重緩沖液）進(jìn)行洗脫。層析方法流程可以在下圖中看到。

3 病毒滅活，除病毒過濾

低pH保持1小時(shí)。最終病毒過濾使用納濾膜進(jìn)行除病毒過濾。病毒清除率驗(yàn)證研究可在之后的研究中進(jìn)一步研究。

4 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和殘余DNA濃度的檢測

中國倉鼠卵巢宿主細(xì)胞蛋白（CHO HCP）分析使用了ELISA試劑盒。使用qPCR定量分析殘余DNA。

結(jié)果與討論

純化方法的A方法和B方法在最終的純化中均產(chǎn)生了可比的質(zhì)量。使用相似的材料和兩個(gè)可互換的層析程序，我們獲得了最終的目標(biāo)產(chǎn)物，目標(biāo)抗體在CHO HCP中的含量小于100ppm，10pg DNA/mg，單體百分含量＞95％（通過體積排阻HPLC測定）。

下表1A總結(jié)了A方案使用CEX色譜進(jìn)行捕獲時(shí)獲得的結(jié)果。這種“方法”被四種不同的抗體采用。在第一根色譜柱后，宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)含量降低了50-200倍，濃度范圍從約900-6000 ng/mg降低，在HCI層析柱后，其濃度降低至小于100ng/mg。CEX層析非常有效地清除了DNA（達(dá)7000倍），而HCl層析將殘留的痕跡進(jìn)一步減少至少于10pg DNA/mg抗體。
方案B產(chǎn)生了相當(dāng)質(zhì)量的結(jié)果（下表1B）。HCP被HCI降低了約90倍。與捕獲的CEX層析相比，DNA的清除效率更高，使測量結(jié)果低于設(shè)定的最終檢測量，這強(qiáng)調(diào)了疏水層析在清除核酸方面的高效率。

在兩個(gè)方法上，HuMAb-1和HuMAb-2純化方案最終純度（單體％）和總回收率非?？杀龋悍謩e超過99％和70％。

下表2總結(jié)了提出的其他兩種單克隆抗體純化方法的可擴(kuò)展性。用DNA測量觀察到最大的變異性。所有其余參數(shù)都非?？杀取Ｗ罱K純化的結(jié)果保持了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的質(zhì)量。隨著規(guī)模擴(kuò)大，重復(fù)值往往會更好。

病毒清除

監(jiān)管機(jī)構(gòu)需要至少兩個(gè)單獨(dú)的步驟來在生產(chǎn)治療性蛋時(shí)進(jìn)行病毒滅活和清除。這些步驟必須基于不同的作用方式，通常是低pH病毒滅活和病毒過濾2個(gè)步驟。病毒滅活通常位于層析純化步驟之間，但該步驟也可以位于兩個(gè)純化步驟之后。類似地，在第二個(gè)純化步驟之后進(jìn)行另外的特定步驟，例如病毒清除過濾。

下表3顯示了使用方案A的HuMAb-6和HuMAb-7的病毒清除率。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒顆粒量有多達(dá)10log的感染性和非感染性病毒顆粒。對于該過程，A-MuLV清除的最小安全系數(shù)分別為HuMAb-6和HuMAb-7在7至10 log之間。因此，最終的抗體產(chǎn)品（抗體和殘留的過程污染物）具有足夠的病毒清除率和安全性病毒因子，可將其用作治療制劑。

結(jié)論

隨著抗體生產(chǎn)中表達(dá)量的提高，純化過程必須提高過程效率和生產(chǎn)率。通過減少純化過程步驟的數(shù)量，可以減少要制備的緩沖液的數(shù)量和過程成分。我們今天描述的兩種純化技術(shù)設(shè)計(jì)僅需對過程進(jìn)行少量調(diào)整即可用于各種類型的蛋白質(zhì)純化。該方案是后續(xù)優(yōu)化和更新步驟的起點(diǎn)，因?yàn)榧兓瘏?shù)通常可以優(yōu)化，例如針對更高的結(jié)合能力范圍。使用此方案的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以靈活選擇特定產(chǎn)品或生產(chǎn)設(shè)施，使得純化工藝是最方便的工藝步驟。