隨著生物制藥行業(yè)的飛速發(fā)展，各大藥企將會(huì)布局越來越多的研發(fā)管線以及開發(fā)多樣化的藥物分子。近些年，隨著藥品審評(píng)審批制度的改進(jìn)，使得大批生物藥進(jìn)入臨床的步伐大大加快。對(duì)于生物制藥企業(yè)而言，機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，生物制藥的競爭將會(huì)愈演愈烈，一方面，如何有效降低成本，造福更多的患者；另一方面，如何提高產(chǎn)品質(zhì)量，贏得更多的市場份額，已成為生物制藥企業(yè)的生存法則。

為了有效地降低生產(chǎn)成本，提高廠房利用率，需要新技術(shù)的變革。越來越多的生物制藥巨頭已轉(zhuǎn)向連續(xù)生物生產(chǎn)工藝。例如，早在2016年4月，美國強(qiáng)生公司藥品生產(chǎn)基地的連續(xù)制造生產(chǎn)車間工藝變更獲得FDA批準(zhǔn)，這是FDA第一次批準(zhǔn)批次制造向連續(xù)制造的生產(chǎn)工藝變更，目前有三個(gè)抗體品種已開始使用連續(xù)制造工藝。禮來制藥將愛爾蘭建設(shè)全球連續(xù)制造中心，葛蘭素史克在新加坡建立了連續(xù)制造工廠，安進(jìn)在新加坡也建立了單克隆抗體的連續(xù)純化制造車間。最近，Biosana Pharma宣布其開發(fā)的奧馬珠單抗生物類似藥獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)，是目前第一個(gè)使用全連續(xù)生產(chǎn)工藝開發(fā)的單克隆抗體藥物。

生物制藥目前都是以批次生產(chǎn)的方式，即從工藝起點(diǎn)開始，經(jīng)過多個(gè)有停頓的中間步驟，最終獲得終產(chǎn)品的過程。連續(xù)生產(chǎn)工藝即連續(xù)生產(chǎn)，在食品，石化和化學(xué)品生產(chǎn)上已經(jīng)被使用多年，和批次生產(chǎn)不同的是，連續(xù)生產(chǎn)中原料在工藝起點(diǎn)持續(xù)加入，終產(chǎn)品在終點(diǎn)持續(xù)收獲，理論上中間沒有停留的步驟，所以被稱之為連續(xù)生產(chǎn)。在這一過程中，藥品質(zhì)量在生產(chǎn)過程中可以被很好的控制，而不是只依靠終產(chǎn)品達(dá)標(biāo)來進(jìn)行質(zhì)量放行。

1 連續(xù)純化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

蛋白產(chǎn)物完成初級(jí)回收后，需要進(jìn)一步捕獲和精純。捕獲是一個(gè)捕獲靶分子并系統(tǒng)的去除雜質(zhì)的粗提過程，精純是基于捕獲過程進(jìn)一步捕獲靶分子并去除特定的如DNA、內(nèi)毒素、可溶性聚集體和電荷變體等雜質(zhì)的精純過程。如對(duì)產(chǎn)物純度要求較高往往需要將捕獲和精純聯(lián)用，例如，使用蛋白A 柱層析來純化單克隆抗體( monoclonal antibody，mAb) 后需要再一次精純?nèi)コ龅牡鞍譇( 假定蛋白A 用于初始捕獲)。柱層析仍然是生物制品捕獲和精純的主要方法，但在實(shí)際生產(chǎn)中使用傳統(tǒng)層析會(huì)面臨兩個(gè)問題:

系統(tǒng)缺陷:常規(guī)柱層析以批次模式運(yùn)行，緩沖液和介質(zhì)的利用率低。其次，受柱壓影響，層析柱體積無法擴(kuò)大，蛋白類產(chǎn)物易失活且處理效率及回收率低;

生產(chǎn)體系缺陷: 通常蛋白類分子的生產(chǎn)都會(huì)伴隨多種雜質(zhì)出現(xiàn)，其中一些雜質(zhì)與靶分子具有相似的吸附性質(zhì)，在過柱分離容易與產(chǎn)物相互重疊，造成產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量相互制約，增加純化難度和成本。

連續(xù)純化技術(shù)主要有以下優(yōu)點(diǎn)：

整合所有的步驟、可連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)、系統(tǒng)匹配性強(qiáng)；

設(shè)備結(jié)構(gòu)緊湊、管路少、占地面積少；

對(duì)層析填料利用率高；

產(chǎn)品收率、濃度及純度高，并且穩(wěn)定性比較好；

用于平衡、淋洗、洗脫的緩沖液和化學(xué)試劑耗量少；

具有良好的操作彈性，可根據(jù)生產(chǎn)負(fù)荷的變化自動(dòng)調(diào)節(jié)生產(chǎn)速度或調(diào)節(jié)流速；

2 連續(xù)純化技術(shù)的應(yīng)用

為了克服傳統(tǒng)層析工藝的缺陷，適應(yīng)上游細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，以及蛋白表達(dá)量的提升，工藝開發(fā)專家開發(fā)出了連續(xù)純化技術(shù)。開發(fā)了連續(xù)環(huán)狀層析(continuous annular chromatography，CAC)，徑向流層析(radial flow chromatography，RFC) ，膨脹床吸附層析(expansion bed adsorption chromatography，EBA ) ，多層逆流溶劑梯度層析( multi-layer countercurrent solvent gradient chromatography，MSCGP)、周期性逆流動(dòng)層析(periodic counter-currentchromatography，PCC) 、連續(xù)逆流切向?qū)游?continuous countercurrent tangential chromatography，CCTC)、模擬移動(dòng)床層(simulated moving bed，SMB) 等連續(xù)多柱層析技術(shù)。

2.1 周期性逆流動(dòng)層析

PCC是由Cytiva（原GE醫(yī)療生命科學(xué)事業(yè)部）開發(fā)，用來連續(xù)捕獲蛋白質(zhì)的方法。如下圖所示為3柱PCC，所有的吸附柱串 聯(lián)連接形成吸附列。物料從第一列開始加載，當(dāng)?shù)谝?列飽和時(shí)，根據(jù)流向切換其位置，物料加載位置變?yōu)榈诙?，然后?duì)第一列單獨(dú)進(jìn)行洗滌，洗脫，再生和平衡操作(洗脫液連續(xù)加載到第三列，進(jìn)一步捕獲第一列未結(jié)合的目的蛋白)，平衡后的第一列通過位置切換變成第三列，整個(gè)過程以此方式循環(huán)運(yùn)行。與常規(guī)(單柱)層析相比，PCC 的樹脂容量和利用率更高但緩沖液的消耗更低。基于其工作原理，PCC系統(tǒng)的設(shè)計(jì)必須確保蛋白質(zhì)加載時(shí)間大于或等于第一列洗脫和再生的時(shí)間。
這種3柱周期性逆流層析(three columns periodic counter-current Chromatography，3C-PCC)工藝，對(duì)比常規(guī)蛋白A批次處理，PCC系統(tǒng)的處理效率提高了60%，緩沖液和層析填料消耗量降低了60%。其次，PCC系統(tǒng)與批次處理對(duì)比發(fā)現(xiàn)在相同條件下PCC系統(tǒng)最高可降低75%的層析填料消耗，這也意味著緩沖液消耗也減少，有效降低了工藝成本?；谄湓鞵CC多柱層析常應(yīng)用于mAb的初始捕獲，當(dāng)使用PCC處理高滴度產(chǎn)品時(shí)，其捕獲柱的加載時(shí)間會(huì)急劇縮短。

2.2 模擬移動(dòng)床層析

SMB系統(tǒng)是利用差示色譜來連續(xù)(循環(huán))分離二元混合物，SMB系統(tǒng)使用多個(gè)填充柱，以模擬逆流(但沒有固相運(yùn)動(dòng))的方式定期切換進(jìn)料、流動(dòng)相、回收端口，以此來增加兩相之間的傳質(zhì)推動(dòng)力。如下圖所示為典型的4列配置，系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，物料(產(chǎn)品和雜質(zhì)的二元混合物)被加載到右上角的第1列。兩種組分都隨著柱子遷移，然后從柱子出口處的端口開始回收結(jié)合力較弱的物質(zhì)(此時(shí)為產(chǎn)品)，與此同時(shí)，在第2列和第3列之間可添加額外的流動(dòng)相，從第3列中回收結(jié)合力較強(qiáng)的成分。隨著大部分產(chǎn)物隨第1列遷移，進(jìn)料位置，流動(dòng)相位和回收端口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)(與流動(dòng)方向相同)以此來模擬固相的逆流運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)行模式可極大的降低緩沖液的消耗，同時(shí)增加樹脂的利用率，有效降低工藝成本。
SMB技術(shù)主要用于蛋白質(zhì)脫鹽，病毒純化，核苷純化和融合蛋白重折疊。工業(yè)上主要用于石化和制糖行業(yè)的大規(guī)模分離。目前，它還被應(yīng)用于制藥工業(yè)中手性藥物及其對(duì)映體的分離。利用以親和層析為基礎(chǔ)的SMB系統(tǒng)對(duì)單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)進(jìn)行純化，結(jié)果顯示相比批次處理SMB的產(chǎn)量提高了 9%，生產(chǎn)率提高了 11倍。為了提高系統(tǒng)處理效率及回收率，在操作過程可將部分產(chǎn)物重新混入進(jìn)料進(jìn)行回填操作。還設(shè)計(jì)了一種快速駐波用來優(yōu)化其操作參數(shù)(流量和端口切換時(shí)間)，使其過程性能(如解吸劑使用量和產(chǎn)量)保持最佳狀態(tài)。SMB為多柱串聯(lián)模式對(duì)二元以上的混合物具有較好的分離效果，但其串聯(lián)模式使得產(chǎn)物的純度和回收率之間容易形成制衡。

2.3 連續(xù)逆流切向?qū)游?/h3>
連續(xù)逆流切向?qū)游鱿到y(tǒng)由3列CCTC體系組成，層析柱由多個(gè)獨(dú)立模塊代替，每個(gè)獨(dú)立模塊由一個(gè)或多個(gè)階段組成，每個(gè)階段包括相互連接的切向流過濾器和靜態(tài)混合器，靜態(tài)混合器控制物料停留時(shí)間，中空纖維膜保留大的樹脂顆粒，同時(shí)讓所有溶解的物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)和緩沖劑組分通過膜進(jìn)入滲透物。系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)物料與漿液形式的色譜樹脂混合，按一定順序通過每個(gè)模塊，每個(gè)模塊對(duì)樹脂進(jìn)行類似的操作(結(jié)合，淋洗，洗脫，再生和平衡)。在結(jié)合，淋洗，洗脫和再生步驟中使用的緩沖液在每個(gè)步驟內(nèi)以多級(jí)配置與樹脂漿液逆向流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)高回收率和高純度回收，同時(shí)降低緩沖液消耗。

利用CCTC系統(tǒng)對(duì)蛋白A操作后的抗體進(jìn)行精純，將CCTC用于捕獲后抗體純化步驟。在蛋白A操作之后，使用具有兩種不同粒度的混合模式陽離子交換-疏水作用層析樹脂來減少宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP) ，浸出的蛋白A，DNA和來自mAb中的聚集體。最終結(jié)果顯示其生產(chǎn)率高達(dá)100g/L填料/小時(shí)，比批次處理高了10倍，隨后在(pH 4～4.5)內(nèi)對(duì)洗脫pH進(jìn)行優(yōu)化，使產(chǎn)量增加了5%.最后還將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了放大設(shè)計(jì)，預(yù)測了500L和2000L批次的簡潔型CCTC流動(dòng)路徑。利用CCTC成功從澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液中初始捕獲和純化了兩種單克隆抗體，其產(chǎn)品質(zhì)量與用填充柱蛋白A層析法得到的相似。

3 整合上下游連續(xù)生產(chǎn)

目前預(yù)想中的完全連續(xù)式生產(chǎn)是從生物反應(yīng)器到藥物原液 (DS) 的產(chǎn)出，密閉式系統(tǒng)、無菌、全自動(dòng)、總體的生產(chǎn)工藝控制，以及能夠長時(shí)間的操作。高密度細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞滯留裝置、分離細(xì)胞后的收獲液直接經(jīng)過不同柱子的連續(xù)純化技術(shù)進(jìn)行捕獲和純化、TFF進(jìn)行濃縮和透析、以及病毒去活化、病毒過濾、無菌過濾等步驟，利用過程分析技術(shù)即時(shí)監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，最后產(chǎn)出藥物原液。

現(xiàn)在能夠利用上游灌流式培養(yǎng)將生物反應(yīng)器與下游2個(gè)PCC單元結(jié)合，可以做到捕獲和下一步的離子交換純化步驟，雖然不是完全的連續(xù)式生產(chǎn)，但使得完全式的連續(xù)式生產(chǎn)的開發(fā)又更進(jìn)一步。這套連續(xù)式系統(tǒng)，包含了一個(gè)12L生物反應(yīng)器、ATF、和2個(gè)PCC系統(tǒng)，其中PCC系統(tǒng)是定制化的AKTA層析系統(tǒng)，最多可以用4根柱子，搭配了5個(gè)UV監(jiān)測器，3個(gè)泵、多個(gè)閥、和酸堿度及電導(dǎo)度儀。如下圖。

這套系統(tǒng)一共連續(xù)運(yùn)行了31天，產(chǎn)出31個(gè)原液批次（以時(shí)間定義批次，一天一批次），抗體的產(chǎn)率約為10g/day（CHO細(xì)胞），并且持續(xù)送往親和性管柱和離子交換管柱進(jìn)行純化，最后原液約為8g/day (回收率約為80%)，循環(huán)時(shí)間從澄清的收獲液到原液約為7小時(shí)。連續(xù)式下游純化的結(jié)果與用批次純化的方式具有可比性，宿主細(xì)胞蛋白清除約4log，殘留protein A小于1ppm，聚集體的比例小于5%。關(guān)鍵產(chǎn)品特性也符合指定規(guī)格與批次純化也具有可比性。此套系統(tǒng)證明連續(xù)式生產(chǎn)的產(chǎn)品與用批次生產(chǎn)的產(chǎn)品皆能符合產(chǎn)品規(guī)格，此外，與批次生產(chǎn)的工藝相比，此連續(xù)式工藝，上游產(chǎn)率超過10倍，下游純化超過6倍，緩沖液的使用和層析柱尺寸也有明顯降低。

4 總結(jié)和展望

連續(xù)多柱層析具有諸多優(yōu)勢(shì)，在許多行業(yè)中將批處理轉(zhuǎn)化為連續(xù)處理已經(jīng)取得成功，但其在生物制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用目前相對(duì)慎重。主要原因是從批量生產(chǎn)轉(zhuǎn)向連續(xù)生產(chǎn)過程中的監(jiān)管要求的不確定性導(dǎo)致。其次，對(duì)比批次處理，從經(jīng)濟(jì)角度來看連續(xù)處理的優(yōu)勢(shì)明顯，它能在更短的加工時(shí)間內(nèi)提高生產(chǎn)率，同時(shí)降低總成本，減少設(shè)備占地面積并保證產(chǎn)品質(zhì)量。但是，連續(xù)處理的操作和過程控制復(fù)雜，而且連續(xù)系統(tǒng)的初始設(shè)備成本及維護(hù)成本較高，普遍適用性較低，通常只針對(duì)特定的產(chǎn)物有較好分離純化效果。因此連續(xù)技術(shù)的廣泛應(yīng)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

連續(xù)技術(shù)可有效降低生物制品的下游純化成本，提高生產(chǎn)效率。未來想進(jìn)一步降低生物藥物的開發(fā)成本，可在連續(xù)模式的基礎(chǔ)上對(duì)下游純化工藝中的核心技術(shù)“層析”進(jìn)一步優(yōu)化或者開發(fā)新型技術(shù)。隨著生物藥品全球銷售額的增加，賣的最好的藥都是來自于生物藥工藝，加上生物相似藥的競爭，價(jià)格會(huì)是未來生物藥的決戰(zhàn)點(diǎn)，而成本決定了藥品的價(jià)格，如何提升產(chǎn)量、降低成本則成為生物制品開發(fā)的重點(diǎn)，根據(jù)模型計(jì)算，整合式連續(xù)生產(chǎn)工藝可以比傳統(tǒng)批次生產(chǎn)工藝降低約55%的成本，顯示整合式連續(xù)生產(chǎn)有機(jī)會(huì)能同時(shí)達(dá)到高產(chǎn)量和低成本，而接下來會(huì)著重于如何整合上游和下游工藝，從細(xì)胞培養(yǎng)開始到原液產(chǎn)出，密閉式系統(tǒng)和使用一次性產(chǎn)品，減少污染，加入自動(dòng)化操作，減少人為因素，實(shí)時(shí)監(jiān)控生產(chǎn)過程，完整的風(fēng)險(xiǎn)控制策略，以及法規(guī)單位的考量等等。

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