雙特異性抗體（BsAb）又稱雙功能抗體，可同時(shí)識(shí)別兩種不同的抗原和表位，并且阻斷兩種不同的信號(hào)通路以發(fā)揮作用。

BsAb與普通抗體相比增加了一個(gè)特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

（1）能夠介導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷

（2）雙靶點(diǎn)信號(hào)阻斷，發(fā)揮獨(dú)特的或重疊的功能，有效防止耐藥

（3）具備更強(qiáng)特異性、靶向性和降低脫靶毒性

（4）有效降低治療成本

目前雙特異性抗體的制備方法主要有化學(xué)偶聯(lián)、雙雜交瘤細(xì)胞法、重組基因制備法等。

1 化學(xué)偶聯(lián)法

該方法最早出現(xiàn)于上世紀(jì)80年代，其原理是通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)劑（如鄰苯二馬來(lái)酰亞胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸鹽、二硫代酰基苯甲酸等）將兩個(gè)完整IgG或兩個(gè)F(ab)2抗體片段偶聯(lián)成一種BsAb，這種方法快速簡(jiǎn)便，但是容易破壞抗原結(jié)合部位從而影響抗體活性，同時(shí)交聯(lián)劑本身的安全性和致癌性也不確定。

圖1所示為使用化學(xué)偶聯(lián)法生產(chǎn)的雙特異性抗體快速檢測(cè)食物中的病原菌。

用紅細(xì)胞與弗氏佐劑完全融合（150 mg）混合物注射入雌性家兔，初級(jí)免疫21天后注射100 mg的紅細(xì)胞與弗氏佐劑完全融合（150 mg）混合物進(jìn)行二次免疫，第28天后從血漿中獲得血清，利用交聯(lián)紅細(xì)胞吸附柱獲得特異性紅細(xì)胞抗體。將李斯特菌細(xì)胞表面蛋白與弗氏佐劑乳化（100 mg）注入雌性家兔進(jìn)行免疫，21天后增加50 mg抗體進(jìn)行主要免疫，5天后采集血清，將血清純化并用李斯特菌親和柱獲得anti-Listeria抗體。

通過(guò)增加β-巰基乙磺酸鈉鹽和β-巰基乙醇的濃度（0-60 mM）,從而有效還原單抗和多抗之間的二硫鍵，單源抗體通過(guò)添加等體積的2倍濃度的蒸餾水溶解的β-巰基乙磺酸鈉鹽（60 mM），將此溶液與混合了1 mg鼠源單克隆的anti-L、產(chǎn)單核細(xì)胞LZH1IgG1和鼠源單克隆IgG2a上調(diào)的對(duì)抗人紅細(xì)胞膜表面蛋白（protein4.2（2G-12））的PBS溶液中，37℃孵育25 min。隨后單價(jià)的抗體暴露在氧化條件下，再通過(guò)針對(duì)3種緩沖液的PBS進(jìn)行透析，pH7.4，4℃24 h。用同樣的方法使用人類紅細(xì)胞或L-單核細(xì)胞表面抗原純化，單克隆和多克隆的雙特異性抗體通過(guò)含有親本抗體的親和柱進(jìn)行純化，從而獲得含有兩種抗體的雙特異性抗體。
圖2所示為化學(xué)偶聯(lián)法合成的雙特異性抗體。

首先獲得抗腫瘤（α-T）和抗半抗原（α-H）的Fab片段的抗體。先將抗腫瘤Fab’與雙功能的N, N' -o-苯乙烯-二馬來(lái)酰亞胺（PDM）連接，隨后將抗半抗原的Fab’片段加入，形成穩(wěn)定的Fab’×Fab’的雙特異性抗體。

2 雙雜交瘤融合法

通過(guò)細(xì)胞融合的方法將2株不同的雜交瘤細(xì)胞融合成雙雜交瘤細(xì)胞株，然后通過(guò)常規(guī)的雜交瘤篩選法克隆靶細(xì)胞。

由于雙雜交瘤的遺傳背景來(lái)源于親代的兩種雜交瘤細(xì)胞，它必然要產(chǎn)生2種重鏈和2種輕鏈分子，而這些輕重鏈的隨機(jī)組合配對(duì)方式才能產(chǎn)生所需的BsAb。利用雙雜交瘤方法制備BsAb隨機(jī)性較大，效率低，但是BsAb生物活性較好，抗體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。利用Konck-in-hole技術(shù)可以有效解決異源抗體重鏈正確配對(duì)的難題。

制備方法是將一個(gè)抗體的重鏈CH3區(qū)366位體積較小的蘇氨酸突變?yōu)轶w積較大的酪氨酸，形成突出的“杵”型結(jié)構(gòu)；

將另一個(gè)抗體重鏈CH3區(qū)407位較大的絡(luò)氨酸殘基突變成較小的蘇氨酸，形成凹陷的“臼”型結(jié)構(gòu)；

利用“杵臼”結(jié)構(gòu)的空間位阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩種不同抗體重鏈間的正確裝配。


每個(gè)雜交瘤細(xì)胞預(yù)先與特異性抗原刺激進(jìn)而產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。將此兩個(gè)表達(dá)特異性抗體的細(xì)胞融合在一起，獲得雜交瘤細(xì)胞且同時(shí)具有兩個(gè)親本的重鏈和輕鏈，此融合的雜交瘤細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)雙親的和兩者混合的免疫原性。

此雙細(xì)胞融合技術(shù)是產(chǎn)生雙特異性抗體的基礎(chǔ)，但由此產(chǎn)生的雙特異性抗體產(chǎn)量低且具有較強(qiáng)的產(chǎn)物異質(zhì)性。隨機(jī)產(chǎn)生的兩種重鏈和輕鏈可以產(chǎn)生10種不同的分子結(jié)構(gòu)且只有一種具有雙特異性抗體的功能。通過(guò)雙雜交瘤產(chǎn)生有功能雙特異性抗體的比例是不可預(yù)知的，工作量較大，從雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的所有種類的雙特異性抗體篩選出需要的雙抗是個(gè)十分困難的工作。


圖4所示，此雙特異性抗體由2個(gè)Fab結(jié)構(gòu)域和一個(gè)具有生物學(xué)功能的二聚體的Fc結(jié)構(gòu)域。

抗體在自然狀態(tài)下的成熟過(guò)程中，重鏈先通過(guò)二聚體作用，隨后輕鏈與之配對(duì)。由于抗體分子裝配的臨界狀態(tài)，維持這個(gè)過(guò)程是十分合適的，在這個(gè)過(guò)程中重鏈/重鏈和重鏈/輕鏈的組合是自然發(fā)生的。因此，我們選擇合成的兩個(gè)抗體臂，其中一個(gè)臂具有二聚體的Fc結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)則沒(méi)有。并將兩個(gè)抗體臂分別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，以此來(lái)消除重/輕鏈的錯(cuò)配。選擇對(duì)功能影響較小的絞鏈區(qū)連接兩個(gè)臂，連接方法可以通過(guò)化學(xué)法或酶方法完成，在此方法中，選擇了一個(gè)裂解肽，能夠通過(guò)“PTS”催化作用將兩個(gè)臂連接。兩個(gè)mAbs攜帶必要的內(nèi)源肽組分并通過(guò)“PTS”功能連接，如圖4所示。我們把此分子結(jié)構(gòu)叫做“BAPTS”（雙特異性抗體通過(guò)蛋白質(zhì)反式剪接），此方法解決了重/輕鏈錯(cuò)配的問(wèn)題。此“Knobs-into-Holes”或者別的Fc工程方法能夠都能夠用于此方法進(jìn)而提高重鏈/輕鏈的錯(cuò)配問(wèn)題。

3 重組基因

利用基因工程技術(shù)制備BsAb是目前最常用的制備方法，其制備原理為利用基因工程技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)抗體進(jìn)行基因工程方面的改造，從而形成多種形式的雙特性抗體。

主要通過(guò)兩種途徑實(shí)現(xiàn)，其一是將編碼兩種單抗的重/輕鏈基因同時(shí)轉(zhuǎn)入骨髓瘤細(xì)胞系，或是將一種單抗的輕、重鏈基因轉(zhuǎn)入可分泌另外一種單抗的雜交瘤細(xì)胞中；其二是通過(guò)構(gòu)建單鏈抗體制備的。

圖5所示為基因工程方法構(gòu)建雙特異性抗體。


其分子構(gòu)成主要包括hBS14（anti-CEACAM5×anti-679HSG）和幾個(gè)反式-Fab（TF）片段結(jié)構(gòu)，每一個(gè)都能結(jié)合一個(gè)不同的腫瘤抗原，但所有的抗原都是anti-HSG半抗原結(jié)合抗體。

其中hBs14結(jié)構(gòu)由單克隆抗體獲得，反式-Fab中的Dock-and-Lock結(jié)構(gòu)由2個(gè)單獨(dú)的克隆產(chǎn)生。其中一個(gè)產(chǎn)物為抗腫瘤蛋白質(zhì)，使用二聚域（DDD2）肽序列和對(duì)接結(jié)構(gòu)，半胱氨酸放在一個(gè)重要的位置成為一個(gè)設(shè)計(jì)的DDD2結(jié)構(gòu)。Fab-DDD2組成一個(gè)二聚體，此二聚體結(jié)構(gòu)有一個(gè)對(duì)接結(jié)構(gòu)與將會(huì)與錨定結(jié)構(gòu)域連接，并用2個(gè)半胱氨酸（AD2）修飾。這個(gè)結(jié)構(gòu)將會(huì)一方面結(jié)合腫瘤，另一方面結(jié)合半抗原。