建立蛋白質(zhì)純化工藝時，最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的數(shù)量及純度都必須滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。而且，因?yàn)楹罄m(xù)研究需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)行為的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過程中，很多處理方法都會對蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細(xì)計劃，在最短時間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在最穩(wěn)定的條件下進(jìn)行保存才算是成功地完成了其整個純化過程。

緩沖液體系

每一步純化過程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。

緩沖液是一種含有共軛酸/堿對的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時的pH值 （圖1）。關(guān)于緩沖液的一個常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。

一種好的緩沖液必須具有以下特征  :

水溶性

化學(xué)穩(wěn)定性

在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力

與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件具有良好的兼容性

與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性

很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對蛋白質(zhì)純化過程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點(diǎn)。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。

溶液添加劑

除了一個合適的緩沖液體系，蛋白質(zhì)純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和活性方面均具有一定作用的成分。

溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因?yàn)榇藭r幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標(biāo)蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護(hù)蛋白質(zhì)不被破壞和增強(qiáng)其溶解性。


添加劑只在必要時才使用。可能需要多次嘗試才能確定某些添加劑是否對一些特定蛋白質(zhì)的純化工藝有效。

表達(dá)系統(tǒng)的影響

開始純化蛋白前應(yīng)先制備初始樣品。真正進(jìn)行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來源。樣品來源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。雖然后基因組學(xué)領(lǐng)域的研究者很少使用原始組織純化蛋白，但當(dāng)研究者想要關(guān)聯(lián)某一蛋白序列的催化活性時，會有這樣的需求。

當(dāng)前，更為常見的是從重組來源的樣品純化蛋白質(zhì)。一些重要決定需要提前考慮以便優(yōu)化后續(xù)的純化。研究者需要考慮蛋白質(zhì)的最終用途（例如酶測定，結(jié)構(gòu)研究，抗體生成），因?yàn)檫@將決定最終蛋白質(zhì)制備所需的量和純度。盡管蛋白質(zhì)表達(dá)的詳細(xì)討論超出本文范圍，但是在這一點(diǎn)上仍有幾個值得考慮的基本點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懞罄m(xù)的蛋白純化。

哪個系統(tǒng)的表達(dá)水平最高？一般規(guī)則是，表達(dá)水平越高，越容易獲得大量高度純化蛋白。

1.如果選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，最終目的可溶性表達(dá)或不可溶表達(dá)是包涵體形式嗎？由于包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構(gòu)成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨后包涵體中再折疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的最終產(chǎn)量相平衡 。已經(jīng)有許多工作優(yōu)化了從包涵體中產(chǎn)生功能蛋白的產(chǎn)量 。

2.另一個考慮是是否靶向胞內(nèi)或胞外（分泌的）表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)需要將蛋白質(zhì)從大量宿主細(xì)胞蛋白中純化而來。相比之下，特別是當(dāng)宿主細(xì)胞在無血清條件下生長時  ，目標(biāo)蛋白的有效分泌要求蛋白必須從少量分泌的宿主蛋白中純化而來。

無論目標(biāo)蛋白的來源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時也需要考慮表達(dá)和純化策略。

樣品的制備

目標(biāo)蛋白的胞外分泌可使用簡單快速親和純化方案  ；所需的唯一樣品制備可能需要傾倒貼壁細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或者低速離心以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)然，制備過程的第一步色譜層析時可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調(diào)節(jié)pH，但這些步驟簡單易行。然而，如果第一步純化樣品步驟進(jìn)行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當(dāng)處理大量條件培養(yǎng)基時可能會有技術(shù)難度；根據(jù)培養(yǎng)基的脫鹽體積?？刹捎猛肝龌蝈e流過濾。

如果靶蛋白在胞內(nèi)表達(dá)，則細(xì)胞首先需要通過離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的最大穩(wěn)定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。

接下來，需要有效的細(xì)胞裂解方法。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了各種方法。大腸桿菌可以通過弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規(guī)?；?，超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業(yè)裂解試劑）。通過向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率?；谙礈靹┑牧呀夥浅睾停也粚?dǎo)致細(xì)菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產(chǎn)生具有良好流動特性的樣品，通常需要加入含DNA酶  。

哺乳動物和昆蟲細(xì)胞也可以通過超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度  。

一旦細(xì)胞（微生物/昆蟲/哺乳動物）被裂解，通常需要離心除去細(xì)胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開始用于靶蛋白的柱色譜層析純化。

其它因素

蛋白質(zhì)純化工藝中的其他因素也會對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。對蛋白質(zhì)的處理步驟越少越好，在最短時間內(nèi)采用最少步驟的純化工藝才能保證得到最高產(chǎn)率的活性蛋白質(zhì)。而且，在整個純化過程中，蛋白質(zhì)最好都保持在低溫狀態(tài)。一般純化過程都在4°C進(jìn)行,因?yàn)檫@個溫度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情況下），又可以保證蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。

1.開發(fā)及操作人員對上面內(nèi)容的掌握能力，會影響工藝設(shè)計及操作過程。

2.過程中使用的設(shè)備及儀器的精準(zhǔn)度，穩(wěn)定性也會影響最終的結(jié)果。

3.過程所使用的試劑藥品的質(zhì)量也會引起結(jié)果的偏差。

4.環(huán)境因素除溫度外，潔凈程度也影響最終結(jié)果。

——注：此文內(nèi)容部分整理自互聯(lián)網(wǎng)！