在無數(shù)應(yīng)用中，抗體仍然是非常有用的，包括基礎(chǔ)研究、成像、靶向傳送、色譜、診斷和治療。在生產(chǎn)階段,抗體一般都存在于復(fù)雜的細(xì)胞中，而且它們的大部分應(yīng)用都需要純化后使用。在多種不同的技術(shù)中，親和層析是純化抗體最具選擇性、快速和容易的純化方法。
親和層析的原理是什么？
親和層析是液相層析方法中選擇性和通用性最好的技術(shù)，依賴于蛋白及其配體的可逆性定點(diǎn)結(jié)合，如激素與其受體，酶與其底物，抗體與抗原等?？梢岳眠@種特異性的相互作用，將相互作用物質(zhì)中的一相，被稱為親和配基，固定到柱子上作為固定相來進(jìn)行親和層析。通過親和配基的選擇性吸附，目的蛋白從復(fù)雜組分中洗脫出來。洗脫完畢后，層析柱再生，用于下一個樣品。
親和層析是最常用的生物物質(zhì)分離方法之一，具有特異性高，速度快，操作簡便的特點(diǎn)。成熟的技術(shù)模型包括抗體或者抗體片段、His標(biāo)簽蛋白、GST標(biāo)簽蛋白、蛋白酶、凝血因子等的分離純化。
親和層析組成有哪些？
親和層析可以選擇多種不同類型的結(jié)合劑（配基）和固相支持物（基質(zhì)），通過優(yōu)化不同的屬性，如特異性，選擇性，可重復(fù)性，交聯(lián)化學(xué)，成本有效性等，親和層析可以用來大規(guī)模地純化抗體，獲得想要的產(chǎn)率和純度。多年以來，不斷努力發(fā)現(xiàn)和制造高質(zhì)量的介質(zhì)和配基，輔以優(yōu)化有效的親和層析方法，來達(dá)到以經(jīng)濟(jì)有效方法產(chǎn)生越來越多高純度的目標(biāo)抗體。
表1 用于親和層析的不同基質(zhì)
實(shí)驗(yàn)材料
⒈實(shí)驗(yàn)儀器：
蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；離心管；離心機(jī)；pH試紙；過濾器；玻璃柱。
⒉實(shí)驗(yàn)試劑
TBS緩沖溶液：6.06gTris(50mM),8.78gNaCl(150mM)以及0.5g疊氮化鈉(0.05%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH7.4。
中和緩沖溶液：121.2gTris(1M),87.8gNaCl(1.5M),0.37gEDTA(1mM)及5g疊氮化鈉(0.5%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH8.0。
洗脫緩沖溶液(pH2.7)：將3.75g甘氨酸(50mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH2.7。
實(shí)驗(yàn)方法
⒈準(zhǔn)備蛋白AsepharoseCL-4B親和柱
通常準(zhǔn)備5ml或10ml蛋白AsepharoseCL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側(cè)在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白AsepharoseCL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1ml/分-2ml/分，避免柱干，利用10倍于床體積并經(jīng)過預(yù)冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。
⒉制備抗血清
將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚集。在蛋白質(zhì)解凍過程中出現(xiàn)的聚集可通過37°C預(yù)熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0.05%，4°C，15,000xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經(jīng)過濾器過濾除去多余的脂。
⒊親和層析
將抗體用TBS緩沖溶液以1：5的比例進(jìn)行稀釋，再用過濾器進(jìn)行過濾。以每分鐘0.5ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結(jié)合，需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經(jīng)加入100ul中和緩沖溶液的1.5mlEP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約pH7.4以防止抗體的變性。
在柱中加入10ml,pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至Aλ280nm<0.008。
利用分光光度計(jì)測定各管中蛋白質(zhì)的含量。若蛋白濃度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2°C~8°C保存。
用含0.05%疊氮化鈉的TBS緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲存在2°C~8°C環(huán)境。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度并利用免疫電泳技術(shù)檢查純化后抗體的滴度。
【注意事項(xiàng)】
⒈疊氮化鈉有毒，應(yīng)戴手套并小心操作
⒉ 在純化過程中，預(yù)冷的TBS緩沖溶液可減少蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合和微生物的代謝。
參考文獻(xiàn)：
Arora S, Saxena V, Ayyar BV.Affinity chromatography: A versatile technique for antibody purification.Methods. 2017 Mar 1;116:84-94.
