1、樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫存放5分鐘使其徹底融解。
②兩相分離水相頂層的容積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%以及融解于當中的RNA。
③RNA沉定這時離心前不可見的RNA沉定將在管底端和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗移去上清液，清洗RNA沉定?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干躁小心吸去絕大多數(shù)乙醇溶液，使RNA沉定在室溫空氣中干躁5-10分鐘。
⑥融解RNA沉定融解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其徹底融解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2、RNA質(zhì)量檢測

1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純凈度。
①濃度值測定
A260下讀值為1表示40µgRNA/ml。樣品RNA濃度值(µg/ml)計算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40µg/ml。具體計算如下：RNA溶于40µlDEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495µl的TE中，測得A260=0.21RNA濃度值=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl。取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35µl，剩余RNA總量為：35µl×0.84µg/µl=29.4µg
②純凈度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純凈度，比值范圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
②準備RNA樣品
取3µgRNA，加3倍容積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度值為10µg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察并拍照
RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。

3、樣品cDNA合成

①反應體系
②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4、梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR

①β-actin陽性模板的標準梯度制備陽性模板的濃度值為10的11次方，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為10的10次方，依次稀釋至10的9次方、10的8次方、10的7次方、10的6次方、10的5次方、10的4次方，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號反應物劑量
1SYBRGreen1染料10μl
2陽性模板上游引物F0.5μl
3陽性模板下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6陽性模板DNA5μl
7ddH2O32.5μl
8總?cè)莘e50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系：
序號反應物劑量
1SYBRGreen1染料10μl
2內(nèi)參照上游引物F0.5μl
3內(nèi)參照下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6待測樣品cDNA5μl
7ddH2O32.5μl
8總?cè)莘e50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘，然后93℃1分鐘，55℃2分鐘，共40個循環(huán)。

5、制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系：
序號反應物劑量
110×PCR緩沖液2.5ul
2MgCl2溶液1.5ul
3上游引物F0.5ul
4下游引物R0.5ul
5dNTP混合液3ul
6Taq聚合酶1ul
7cDNA1ul
8加水至總?cè)莘e為25ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）；72ºC延伸5分鐘。
②PCR生成物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR生成物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR生成物進行10倍梯度稀釋:將PCR生成物進行10倍梯度稀釋:設定PCR生成物濃度值為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

6、待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR

①所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應體系。
體系配置如下：
序號反應物劑量
1SYBRGreen1染料10ul
2上游引物1ul
3下游引物1ul
4dNTP1ul
5Taq聚合酶2ul
6待測樣品cDNA5ul
7ddH2O30ul
8總?cè)莘e50ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應溶液置于RealtimePCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然后按93℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

7、實時定量PCR使用引物列表

引物設計軟件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(即錯配)。

8、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行RealtimePCR反應。PCR生成物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView™染色，檢測PCR生成物是否為單一特異性擴增條帶。