為什么要設(shè)計引物

引物是短片段的寡核苷酸，是DNA復制的起點；在生物體內(nèi)可由引物酶（RNA聚合酶）生成引物（RNA短片段）；在DNA延長時，該RNA片段會被DNA片段所取代。由于DNA聚合酶需要3’羥基作為合成起點，故在體外擴增DNA序列時，仍然需要特定的引物去延伸特定的片段區(qū)域。所以為了準確的獲得目標片段，引物序列的設(shè)計就非常重要!
看過一些普通PCR引物設(shè)計的資料和經(jīng)驗貼，整理記錄在這里，方便使用！

設(shè)計引物注意事項

引物長度：引物長度為18~30個bp；太短（15bp以下）的引物結(jié)合高效，但特異性不好。長引物專一性高但退火效率會降低。
引物序列：避免編碼單一、相連堿基重復（3個上述）。
避免序列互補：一條引物內(nèi)的互補堿基不超過三個，否則容易形成引物二聚體。

堿基比例：GC含量40%~60%，避免AT、CG局部富集。A或T富集會使引物不穩(wěn)定；C或G富集會降低退火過程時的專一性。3‘端選用G或C，但不要超過三個。G/C可以增加結(jié)合強度，但過多會降低反應(yīng)專一性。
退火溫度Tm：55℃ 除上述三種Tm值計算方法外，也有其它的方法；無論哪種方法，都不能精確得出Tm值；所以，Tm值只是一個參考區(qū)間，具體操作時還應(yīng)結(jié)合具體情況·進行調(diào)整。

引物保存&配制母液：

凍干粉劑可2~8℃保存；母液-20℃保存；
濃縮母液配制最好使用不含核酸酶的低濃度無菌Tris緩沖液(5-10uM，pH7-8)；
純水雖然也可以用于配制母液，但是其pH會處于4-5，引物在該范圍內(nèi)不穩(wěn)定；
另外，由于PCR反應(yīng)需要Mg2+參與，故應(yīng)避免TE緩沖液，TE中含EDTA，會結(jié)合Mg2+;
母液分裝保存，可避免反復凍融。

上述經(jīng)驗僅針對普通PCR所需引物的設(shè)計！其它較為特殊的擴增過程需要額外的經(jīng)驗規(guī)則。

可以在一些網(wǎng)站在線設(shè)計/查找，比如
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
生工生物也提供免費設(shè)計的服務(wù)，但需要注冊賬號并提交訂單。
除了在線網(wǎng)站，也可以用專業(yè)軟件：Primer、Oligo、VectorNTI、Omiga