在整個(gè)PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進(jìn)行有效的延伸，可見(jiàn)引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。

一、PCR引物設(shè)計(jì)原則

1、引物長(zhǎng)度一般在15-30bp
引物長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應(yīng)大于38bp，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)；
2、引物GC含量一般為40%-60%
引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右
Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳，至少要在55-80℃之間。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)；
4、引物3’端的堿基一般不用A
引物3’端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。
5、引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。
6、引物3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。
7、如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率；
8、引物5’端可以修飾
引物5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。
9、堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross Dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過(guò)高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致引物二聚體帶的 產(chǎn)生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。
10、引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高。
ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對(duì)較高。3'端的ΔG值相對(duì)要低，且絕對(duì)值不要超過(guò)9，引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
11、引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。

二、Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則

Real Time PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。

三、常用的引物設(shè)計(jì)軟件

“Primer premier”，“Oligo”，“Vector NTI Suit”，“DNAsis”，“Omiga”和“DNAstar”。
下面詳細(xì)介紹一下Primer premier 5.0的用法：
1、通過(guò)File下的New或Open載入需要設(shè)計(jì)引物的序列

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2、進(jìn)入到程序的引物設(shè)計(jì)窗口

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3、點(diǎn)擊search，則出現(xiàn)新的界面

在新界面設(shè)置你需要設(shè)計(jì)的引物的相關(guān)參數(shù)。主要有五個(gè)要設(shè)置的地方。
第一個(gè)地方是選擇設(shè)計(jì)PCR引物，測(cè)序引物和雜交探針，如果要做PCR就選第一個(gè)圈圈“PCR Primers”。
第二個(gè)地方是搜尋模式，一般我們搜索引物是以對(duì)搜索，所以一般選"pairs"。
第三個(gè)地方是正負(fù)鏈的所在區(qū)間以及產(chǎn)物的大小長(zhǎng)度，這個(gè)按自己的需要來(lái)，跟實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠嘘P(guān)，具體情況具體分析。第四個(gè)地方是引物的長(zhǎng)度以及正負(fù)波動(dòng)值，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度在18-27范圍內(nèi)。第五個(gè)地方是選擇模式，一般選“Automatic”。設(shè)置完上面所說(shuō)的這些地方后按“OK”鍵，則跳轉(zhuǎn)到新界面。

4、點(diǎn)擊“OK”，出現(xiàn)如下新界面

顯示結(jié)果按照評(píng)估分?jǐn)?shù)從高到低向下排列， 一般選取評(píng)估分?jǐn)?shù)較高的結(jié)果。打分是衡量引物質(zhì)量的綜合性參數(shù)，利用打分系統(tǒng)可以對(duì)引物進(jìn)行有效評(píng)估和引物間進(jìn)行對(duì)比選擇提供有效的證據(jù)。如果我們只想要尋找正向或反向的引物，就可以選擇“Sense”或“Anti-sense”按鈕。
5、點(diǎn)擊評(píng)分高的結(jié)果，就可以顯示引物的詳細(xì)信息，如下圖。

該圖左上角的兩個(gè)按鈕

和

分別代表的是正向和反向引物。該圖中間部分給出了引物的得分，位置，長(zhǎng)度，Tm值，GC含量，自由能等信息。該圖最下面的模塊給出了正反引物是否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二聚體，錯(cuò)配以及引物之間的二聚體等情況，紅色代表有。
點(diǎn)擊

或

我們會(huì)看到出現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)的具體信息，比如開(kāi)始的位置，產(chǎn)生的自由能。
6、如果我們對(duì)搜索到的引物不滿意，可以手動(dòng)調(diào)整引物的位置，同時(shí)可以點(diǎn)擊

的按鈕對(duì)引物進(jìn)行修改。如下圖，我們可以增加，刪除或修改堿基。直到找到最佳的結(jié)果。

7、最后將設(shè)計(jì)好的引物導(dǎo)出或復(fù)制出來(lái)。

四、推薦幾款在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站

1、Primer3
http://bioinfo.ut.ee/primer3/
一個(gè)廣泛使用的PCR引物設(shè)計(jì)程序。
2、Primer-BLAST
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
在線設(shè)計(jì)用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的特異性寡核苷酸引物,這個(gè)工具同時(shí)整合了Primer3和NCBI的Blast功能。
3、GeneFisher
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/
提供一個(gè)在線的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)工具，基礎(chǔ)是同源基因。
4、Primer3Plus
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
5、BiSearch
http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch
特別推薦設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增高度冗余的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物。提供快速的ePCR方法避免非特異性PCR產(chǎn)物。
6、Web Primer
https://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
斯坦福大學(xué)提供的在線引物設(shè)計(jì)軟件,酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提供。
7、AutoPrime
http://www.autoprime.de/AutoPrimeWeb
快速設(shè)計(jì)真核表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR引物在線軟件

注：本文轉(zhuǎn)自知乎，作者 myhalic。植物分子研究整理。