PCR優(yōu)化體系，使你很快地獲得PCR條件：

一、Tm值（MeltingTemperatures）&Ta值（AnnealingTemperatures退火溫度）

你送出去設(shè)計(jì)引物的公司會(huì)在說(shuō)明書(shū)上提供你的寡核苷酸引物的Tm，但是我們發(fā)現(xiàn)不同的公司根據(jù)他們采用的計(jì)算方式所提供的Tm明顯不一樣。我推薦IDTwebsite的引物設(shè)計(jì)工具OligoAnalyzer在優(yōu)化退火溫度方面非常好用~但是我覺(jué)得你還歹自己搞清楚其優(yōu)化的原理，Tm計(jì)算公式如下：
Tm=2(A+T)+4(G+C)
其中A,T,G和C表示你的引物序列中對(duì)應(yīng)的堿基數(shù)

Tm與緩沖液的鹽濃度、pH值以及引物濃度有關(guān)，但是一般人很少去考慮這些。大部分人會(huì)告訴你，為了防止引物二聚體的形成，推薦你退火溫度要比Tm值至少高到10℃。OligoAnalyzer工具在設(shè)計(jì)引物時(shí)也會(huì)考慮到模板DNA的二聚體結(jié)構(gòu)。但是我建議退火溫度設(shè)定值比你兩個(gè)引物最低的Tm低3℃。例如，如果你的前置引物Tm是62℃，后置引物Tm是61℃，那么設(shè)定它們的退火溫度為58℃。
如果你擁有一臺(tái)具有梯度擴(kuò)增功能的PCR儀，同時(shí)具有足夠量的模板，你可以進(jìn)行兩到三次的重復(fù)試驗(yàn)。我建議設(shè)定一定范圍的退火溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并評(píng)估每個(gè)溫度效果。

（這里推薦大家使用本公司代理的雅睿PCR）

二、降落PCR（TouchdownPCR）

我最喜歡的一個(gè)技巧是降落PCR法，在前幾循環(huán)的PCR反應(yīng)中設(shè)置為較高的退火溫度。在每一循環(huán)（或兩個(gè)循環(huán)，或三個(gè)循環(huán)）之后，退火溫度Ta降低1~2℃，這種方法本人屢試不爽。

那么，具體怎么做呢？使用上面的例子，兩條引物的Tm值分別為62℃和61℃，我會(huì)設(shè)置退火溫度Ta在前兩個(gè)循環(huán)是63℃，接下來(lái)的兩個(gè)循環(huán)是62℃，然后是61℃、60℃和59℃，共有10循環(huán)。然后在58℃溫度下進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。這種技術(shù)好處是，前幾個(gè)循環(huán)是非常嚴(yán)格的，所以它是不太可能發(fā)生任何非特異性擴(kuò)增。同時(shí)，當(dāng)退火溫度變得更加容易結(jié)合引物時(shí)，PCR小管就像具有一定量目標(biāo)擴(kuò)增子的水庫(kù)，當(dāng)水庫(kù)中已經(jīng)具有足夠量的目標(biāo)擴(kuò)增子時(shí)，目標(biāo)擴(kuò)增子即可在與非特異性序列的引物爭(zhēng)奪中取得勝利！

以上實(shí)驗(yàn)的前提是確保你的PCR儀能夠準(zhǔn)確、有效地進(jìn)行溫度調(diào)整。我能理解在一個(gè)不能正常工作的PCR儀上會(huì)有多少時(shí)間被浪費(fèi)在優(yōu)化PCR條件，因?yàn)槲页赃^(guò)這樣的苦頭。一般來(lái)說(shuō)，你的PCR儀工作不正常，你的PCR反應(yīng)可能需要比平時(shí)花更長(zhǎng)的時(shí)間。所以在你進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，要確保你的每一步都是能夠工作的！包括你的機(jī)器、設(shè)置的條件以及反應(yīng)條件、反應(yīng)成分（即你以前驗(yàn)證過(guò)的引物、模板和緩沖條件）。

三、DNA模板

PCR需要的模板質(zhì)量會(huì)很高！同時(shí)，過(guò)度的DNA模板含量有可能會(huì)降低反應(yīng)的特異性，增加不必要產(chǎn)物的擴(kuò)增。引物PCR反應(yīng)是非常靈敏的，因此盡可能使用較低濃度的模板量。我們推薦的模板量：
質(zhì)粒DNA模板不超過(guò)1ng；
cDNA：10-40ng；
基因組DNA：1μg。

（測(cè)定蛋白濃度有：NanodropND-2000，以及EppendorfBioPhotometerPlus。有些實(shí)驗(yàn)室資金有限，跑膠跟蛋白marker亮度比對(duì)也不失為一種辦法~）

四、延伸時(shí)間

你曾經(jīng)有沒(méi)有想過(guò)到底是誰(shuí)想出PCR反應(yīng)的條件和方法，使得變性和退火時(shí)間一直以來(lái)都保持一致，只有延伸時(shí)間可根據(jù)你擴(kuò)增大小進(jìn)行調(diào)整。一般的經(jīng)驗(yàn)法則是你每擴(kuò)增1kb需要60秒的延伸時(shí)間（根據(jù)你選用的聚合酶的效率）。例如，如果你擴(kuò)增一個(gè)2kb的片段，你需設(shè)計(jì)120秒的延伸時(shí)間。對(duì)于較短的產(chǎn)物，縮短延伸時(shí)間。對(duì)于一個(gè)200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，15到20秒的延伸時(shí)間是足夠的。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引入不必要的非特異性的PCR產(chǎn)物！

五、聚合酶的選擇

TaqDNA聚合酶在PCR反應(yīng)中用的最多，尤其在驗(yàn)證目的基因的PCR擴(kuò)增中。Pyrococcusfuriosus(PFU)聚合酶則廣泛應(yīng)用于高保真的PCR反應(yīng)中。

但是也有一些其他的聚合酶對(duì)不同的模板有著不一樣的擴(kuò)增效率。比如：如果你的擴(kuò)增模板中含有較高的GC含量（超過(guò)65%），ThermoScientific的AccuprimeG-CRichDNAPolymerase擴(kuò)增的效果將會(huì)更好！而國(guó)產(chǎn)品牌例如巨匠生物ATG的Proofast™Super-FidelityDNAPolymerase在保真度和擴(kuò)增速率上均有不俗表現(xiàn)，當(dāng)你需要進(jìn)行全質(zhì)粒PCR時(shí)大大縮短了時(shí)間。Takara的PrimerSTARMaxDNAPolymerase被做成Mix，在保證高保真前提下方便使用！
（以上這些產(chǎn)品本人曾經(jīng)親自用過(guò)，本公眾號(hào)原則上不打廣告，以上廠家你們看著辦~~哈哈~如果有好的產(chǎn)品可以留言告知?。?

六、緩沖液組分

當(dāng)你購(gòu)買一管DNA聚合酶時(shí)，包裝里會(huì)配備一管已經(jīng)優(yōu)化好的Buffer。正常來(lái)說(shuō)，安裝說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作是不會(huì)錯(cuò)的。但是我認(rèn)為作為一個(gè)研究生，了解Buffer組分和濃度對(duì)PCR效率的影響很有必要。因?yàn)榇蟛糠諦uffer只是簡(jiǎn)單地在某個(gè)pH值下進(jìn)行鹽離子（KCl和MgCl2）的混合。

七、鎂離子

可以調(diào)整鎂離子濃度來(lái)改變PCR的效率和保真度。對(duì)TaqDNApolymerase，優(yōu)化的鎂離子濃度是1.5到2mM，因?yàn)槠渌木彌_液和反應(yīng)所需的組分有可能會(huì)對(duì)鎂離子產(chǎn)生螯合作用，從而需要增加鎂離子濃度。最終在設(shè)定鎂離子濃度時(shí)，會(huì)作一個(gè)小調(diào)整（大約增加0.5mM）

八、引物

需要花一整天來(lái)討論的恐怕就是PCR引物的設(shè)計(jì)了，包括引物長(zhǎng)度、GC含量、Tm值、二聚體等等……

在這里，我就簡(jiǎn)單地介紹優(yōu)化引物濃度。如果添加過(guò)多的引物，會(huì)增加非特異性結(jié)合和引物二聚體。我經(jīng)驗(yàn)，引物濃度推薦設(shè)定為1μM的較低水平效果會(huì)好很多。為了提高特異性，引物濃度甚至可以降到0.1μM，但是可能會(huì)減低PCR產(chǎn)量。

九、dNTPs

dNTPs的濃度不僅會(huì)影響PCR的特異性也會(huì)影響產(chǎn)量。太高濃度的dNTP將會(huì)降低特異性，太低有可能降低產(chǎn)量。然而對(duì)于我來(lái)說(shuō)產(chǎn)量沒(méi)有特異性重要，因此我在我的大部分PCR反應(yīng)中用50μMdNTP濃度。你可以將dNTP濃度提高到200μM來(lái)提高產(chǎn)量。
HopefullythesetipswillgetyouthroughPCRoptimizationquicklyandpainlessly.