pcr循環(huán)測(cè)序法是利用熱循環(huán)儀高效的自動(dòng)循環(huán)能力,使鏈終止的序列產(chǎn)物以線性方式獲得擴(kuò)增,從而產(chǎn)生高顯影度的序列梯度。首先將PCR擴(kuò)增的DNA經(jīng)變性形成單鏈形式,使標(biāo)記引物(P、生物素或熒光標(biāo)記)與其中的一條鏈上的互補(bǔ)序列退火。退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應(yīng)。由此產(chǎn)生的模板鏈與延伸終止鏈形成的部分雙鏈產(chǎn)物在下一輪測(cè)序循環(huán)中,再次被變性,釋放出模板鏈,作為又一輪引發(fā)反應(yīng)的模板,同時(shí)積累下每輪循環(huán)產(chǎn)生的鏈終止產(chǎn)物。這種循環(huán)步驟重復(fù)20~40次,使鏈終止產(chǎn)物以線性方式擴(kuò)增。

與直接測(cè)序法相比較,循環(huán)測(cè)序法有如下優(yōu)點(diǎn):所需的模板DNA量少;在高溫下進(jìn)行,可使DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)能夠通過模板二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域;多輪的變性步驟便于對(duì)質(zhì)粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR產(chǎn)物等雙鏈DNA模板進(jìn)行測(cè)定,不需要經(jīng)過一個(gè)單獨(dú)的變性步驟而直接進(jìn)行測(cè)序。

(1)模板可用PCR擴(kuò)增好的DNA作模板,也可使用低濃度的dNTP(10~20mol/L)和引物(1mmol/L)來進(jìn)行靶DNA的PCR擴(kuò)增,然后直接用PCR產(chǎn)物作為模板。DNA模板濃度:0.01mmol/L

質(zhì)粒DNA模板用質(zhì)粒純化試劑盒提取。對(duì)于高拷貝數(shù)的質(zhì)?？梢灾苯訌木渲蝎@得測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)的質(zhì)粒典型用量:50~200mol

其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制備為常規(guī)分子生物學(xué)手段。M3和ADNA作為模板用量:10~100mo黏粒DNA作為模板用量:50~200mol

(2)測(cè)序引物同位素標(biāo)記測(cè)序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶對(duì)引物的5末端進(jìn)行同位素標(biāo)記。引物濃度:0.1~0.2mmol/L

非同位素標(biāo)記測(cè)序引物:用熒光標(biāo)記4種雙脫氧核苷酸,可以進(jìn)行以熒光為基礎(chǔ)的雙脫氧測(cè)序反應(yīng)。 

(3)DNA聚合酶應(yīng)為無3→5外切活性的耐熱DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。

(4)測(cè)序反應(yīng)緩沖液根據(jù)所用的聚合酶具體而定。 

(5)放射性標(biāo)記的dNTP根據(jù)所用的聚合酶具體而定 

(本操作方法是以同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的測(cè)序)

(1)標(biāo)記引物取10~15pmol測(cè)序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶緩沖液(商品廠家提供),加水至反應(yīng)體系50,混勻后37℃預(yù)熱5min

加人1μ現(xiàn)稀釋的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃繼續(xù)孵育30min。

通過凝膠過濾柱除去未摻入的[yP]ATP

標(biāo)記好的引物可在-70℃保存2周以上。 

(2)制備dNTP/ ddNTP混合物在4個(gè)微量離心管中各加入一種dNTP/ ddNTP混合物2ul

(3)制備反應(yīng)混合物取相應(yīng)的DNA模板、標(biāo)記的測(cè)序引物1~2pmol、3pl的10×測(cè)序反應(yīng)緩沖液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至總體積20l,混勻。在該混合物中加入某些試劑,如DMSO、 Triton X-100、吐溫20或NP40等,徹底混合均勻,可以提高序列梯度的質(zhì)量。

(4)循環(huán)反應(yīng)分別取反應(yīng)混合物4團(tuán)l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的熱循環(huán)儀上進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。每次循環(huán)包括:94℃變性1min、40~60℃退火30s和72℃鏈延伸終止30s。循環(huán)次數(shù):20~40次。

(5)終止反應(yīng)體系循環(huán)結(jié)束后,在各管中加入4pl終止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚藍(lán),0.05%二甲苯腈藍(lán)FF),混勻。樣品可在一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min 

(6)電泳分離和序列判讀每一泳道上樣2~3pl,電泳。采用放射自顯影方法進(jìn)行序列判讀標(biāo)記的需要過夜曝光顯影,若用P標(biāo)記的需要2~3d曝光顯影。

①在標(biāo)記引物過程中,為獲得高比活的標(biāo)記引物,反應(yīng)體系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一個(gè)最佳水平 

②確定最佳dNTP/dNTP比例非常關(guān)鍵,應(yīng)采用產(chǎn)生低本底、高顯影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。 

③為了提高靠近引物(1~100個(gè)堿基范圍內(nèi))的序列梯度的自顯影強(qiáng)度,可以向測(cè)序反應(yīng)體系中加人Mn2,提高DNA聚合酶對(duì)摻入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而當(dāng)為了提高遠(yuǎn)離引物(200~400個(gè)堿基范圍內(nèi))的序列梯帶的自顯影強(qiáng)度,則需要提高鏈延伸終止反應(yīng)混合液中dNTP的含量,具體依所用聚合酶而定。