PCR擴(kuò)增獲得雙鏈DNA產(chǎn)物經(jīng)變性形成單鏈,測序引物與其中一條模板鏈上的互補(bǔ)序列退火。退火的引物在低進(jìn)行性反應(yīng)條件下(如低溫和低dNTP濃度),通過DNA聚合酶催化作用延伸20~80個核苷酸;由于此反應(yīng)體系中摻入放射性標(biāo)記的dNTP,能使新合成的DNA鏈中含有多個放射性標(biāo)記,便于產(chǎn)生高放射顯影度。標(biāo)記的DNA鏈在高進(jìn)行性反應(yīng)條件下,通過DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸,通過在反應(yīng)體系中摻入 ddNTP,使鏈延伸反應(yīng)終止。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過電泳分離和放射自顯影,就可以進(jìn)行序列判讀。

(1)DNA模板PCR產(chǎn)物離子交換色譜純化,作為DNA模板,濃度為:0.01~0.1mmol/L。

(2)引物20個核苷酸的DNA引物可以不經(jīng)過純化,直接用作測序引物,引物濃度 l mmol/L 

(3)DNA聚合酶要求該酶在低溫條件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA鏈中摻入放射性標(biāo)記。比如USB/ Amersham公司生產(chǎn)的測序酶2.0。

(4)測序反應(yīng)緩沖液根據(jù)測序酶具體而定,如測序酶2.0的反應(yīng)緩沖液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.

(5)放射性標(biāo)記的dNTP一般為[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

(1)制備鏈延伸終止反應(yīng)混合物分別在4個微量離心管中各加入一種 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP濃度分別為80m0/L和8pmol/L,37℃預(yù)熱5mine 

(2)制備退火混合物在一個微量離心管中加入PCR擴(kuò)增DNA1pmol,測序引物1012p5×測序反應(yīng)緩沖液,用水調(diào)整至總反應(yīng)體積10pl

在加熱儀內(nèi)94~96℃加熱8min后,迅速放入冰浴中冷卻lmin(適合于雙鏈DNA模板),或者在加熱儀內(nèi)65℃加熱6min后在加熱儀內(nèi)自然冷卻到30℃(適合于單鏈DNA模板)。1000r/min離心10s后在冰浴中冷卻,并迅速進(jìn)行下一步操作。 

(3)標(biāo)記反應(yīng)在退火混合物中加入2l預(yù)冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,現(xiàn)稀釋的測序酶2U,并用水將反應(yīng)體系調(diào)整到15.5,混勻后在冰上孵育2min,放射性標(biāo)記新合成的DNA鏈。

(4)鏈延伸終止反應(yīng)將3.5標(biāo)記混合物分別加入4管鏈延伸終止反應(yīng)混合物中,37℃進(jìn)行鏈延伸終止反應(yīng)5min。

(5)終止反應(yīng)體系在各管中加入4終止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚藍(lán),0.05%二甲苯腈藍(lán)FF),終止反應(yīng)。樣品可以一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min。 

(6)電泳分離和放射自顯影每一泳道上樣2~3μl,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

P標(biāo)記的需要過夜曝光顯影,若用P標(biāo)記的需要2~3d曝光顯影,讀片。

①標(biāo)記反應(yīng)最為關(guān)鍵,應(yīng)在低進(jìn)行性反應(yīng)條件下進(jìn)行。退火后引物只被延伸20~80個核苷酸,并在新合成的DNA鏈中摻入多個放射性標(biāo)記。對高GC堿基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。

②對高GC堿基含量的DNA模板,鏈延伸終止反應(yīng)混合物中應(yīng)用7-脫氧2dGTP替代dGTP,以消除電泳過程由于壓縮現(xiàn)象產(chǎn)生的假帶。