常提到的PCR全部在這里：

1、Colony PCR

在藍(lán)白斑篩選時(shí)常用到的菌落PCR，用滅菌的牙簽挑細(xì)菌菌落，放入PCR混合物中，充分混合一般就可以了。標(biāo)準(zhǔn)的做法是將菌落和Mix的混合液在99℃下處理2-5min，離心，取上清1-2μl加入新的Mix中進(jìn)行PCR反應(yīng)。但是一般直接反應(yīng)，就可以擴(kuò)增出來(lái)?xiàng)l帶。

2、Degenerate PCR

當(dāng)研究是從蛋白質(zhì)出發(fā)時(shí)，常會(huì)用到簡(jiǎn)并PCR。我們已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，但是由于密碼子的簡(jiǎn)并性，無(wú)法得知準(zhǔn)確的DNA序列，這時(shí)候就要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物，可以在擴(kuò)增過(guò)程中保證引物與模板可以配對(duì)。而這種PCR就是Degenerate PCR。

3、Error Prone PCR

這種PCR的目的就是為了產(chǎn)生隨機(jī)突變，用于后續(xù)各種目的的研究。正常PCR中用到的DNA聚合酶有聚合和糾錯(cuò)的兩種功能。在這種PCR中，采用的聚合酶沒(méi)有糾錯(cuò)的功能。那么擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生隨機(jī)突變文庫(kù)。

4、Hot start PCR

減少因?yàn)橐锝Y(jié)合在錯(cuò)誤的位點(diǎn)而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增。首先PCR反應(yīng)混合物在不加入聚合酶的情況下，95℃加熱2min，然后再加入聚合酶，開(kāi)始反應(yīng)。這里面常用的是Eubacterial typeⅠ DNA polymerase，Pfu，它在室溫下活性很低，要溫度大于70℃才有較好的活性。

5、Inverse PCR

用于擴(kuò)增一段已知序列兩側(cè)的未知序列的方法。一段線性的序列，中間的一段是已知的。目前我們PCR都是已知兩端，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增中間部分?，F(xiàn)在變成了兩端未知，那么首先將線性序列自身連接（self ligate），然后再用限制性內(nèi)切酶處理已知的序列，環(huán)狀被剪成了線狀，同時(shí)曾經(jīng)中間的已知序列也變成了兩側(cè)的，可以設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增。

6、Long PCR

一般PCR擴(kuò)增的都是1000bp以內(nèi)或者左右的序列，這個(gè)一般擴(kuò)增5kb，甚至大于10bk長(zhǎng)度的序列。用于長(zhǎng)序列的克隆，但是效率低，要求反應(yīng)有更高的準(zhǔn)確度，一般采用Pfu酶。

7、Multiplex PCR

需要多對(duì)引物，在一個(gè)反應(yīng)里，擴(kuò)增不同的目的序列，當(dāng)然最好相似度低一些的，不然很難設(shè)計(jì)引物區(qū)分。

8、Nested PCR

同樣為了非特異性擴(kuò)增。這種PCR需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。第一對(duì)引物可以擴(kuò)增包含了目的基因的較長(zhǎng)的一段序列，產(chǎn)物再次用第二對(duì)引物擴(kuò)增，第二對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)域被包含在第一對(duì)引物之間。因?yàn)橐镉薪Y(jié)合在錯(cuò)誤位點(diǎn)的可能，所以兩種引物大大的降低了這種概率。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物以達(dá)到擴(kuò)增目的基因的方法還可以用于其他的情況中，以增加擴(kuò)增效率。

9、Quantitative Real-time PCR （qPCR）

是一種實(shí)時(shí)檢測(cè)的熒光定量PCR，非常靈敏。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)檢測(cè)熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，和反應(yīng)總量，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)；通過(guò)加入內(nèi)參或外參或繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可知模板中DNA的量，實(shí)現(xiàn)了定量（絕對(duì)定量/相對(duì)定量）。
常用的熒光方法：
①SYBR Green法，加入該燃料，可以結(jié)合在雙鏈DNA的小溝，并釋放熒光。它的使用很方便，但是不是特異性的。
②TagMan probe，探針可特異性與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)，這時(shí)探針上的Repoter基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)一直被Quencher基團(tuán)吸收。而當(dāng)PCR進(jìn)行時(shí)，Tag酶外切活性將探針降解，Repoter基團(tuán)釋放熒光信號(hào)。這種探針的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可與Multiplex PCR聯(lián)用。
③Molecular Beacon probe，與前一個(gè)探針類似，都是擁有Reporter基團(tuán)Quencher基團(tuán)，增加反應(yīng)特異性，可以與Multiplex PCR聯(lián)用。與TagMan結(jié)合目的片段不同的是，molecular beacon probe通過(guò)Blocker結(jié)合在PCR反應(yīng)的特異性引物上，當(dāng)反應(yīng)開(kāi)始，Tag酶外切，使之釋放熒光。大體與前一個(gè)探針類似。
qPCR中最重要的概念就是cycle threshold(Ct值-循環(huán)閾值)了，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

10、Reverse Transcriptase PCR（RT-PCR）

擴(kuò)增RNA序列，首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA（合成cDNA第一鏈和第二條），后續(xù)進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增。簡(jiǎn)寫(xiě)為RT-PCR，注意不要和實(shí)時(shí)PCR搞混。

11、Touch down PCR

一般用于從較雜的模板中擴(kuò)增目的片段，避免擴(kuò)增非特異性片段，提高準(zhǔn)確度。利用的原理是退火溫度升高，引物特異性提高，引物結(jié)合難度提高，擴(kuò)增效率降低。首先PCR中前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度較高，保證擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn)正確，然后降低溫度，提高效率。要注意的是，這個(gè)方法不能根本解決擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。