如何獲得純凈的目的蛋白?

蛋白純化概念

蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。

常用的四大蛋白純化方法

01親和純化色譜
根據(jù)蛋白與色譜基質(zhì)上偶聯(lián)的特異性配體間的可逆性相互作用分離蛋白。該技術(shù)對(duì)目的蛋白具有高選擇性、高分辨率和高容量。純化回收率通常較高。
02離子交換色譜
不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI, isoelectric point）特性，使在不同pH緩沖液條件下所帶正/負(fù)凈電荷不同，選擇不同的離子交換柱實(shí)現(xiàn)分離。
離子交換層析屬于吸附性分離方式，純化過程中它具有可逆、操控性強(qiáng)及實(shí)現(xiàn)樣品濃縮等特點(diǎn)。在精純實(shí)驗(yàn)中是常與其它方法相結(jié)合使用的主要技術(shù)。
03分子排阻色譜
又稱為凝膠過濾 (Gel Filtration, GF) 色譜。根據(jù)分子大小差異對(duì)通過樹脂的分子進(jìn)行分離。其目的可以是分離其中一種分子或者分析樣品的分子量分布。SEC可提高抗體樣品的純度和均一性。與離子交換或親和色譜不同，該方法中分子不與色譜介質(zhì)結(jié)合。
04疏水作用色譜（HIC)
*注釋：HIC（Hydrophobic Interaction Chromatography）
HIC 根據(jù)抗體表面疏水性的差異，利用這些蛋白與介質(zhì)疏水性表面之間可逆性的相互作用對(duì)其進(jìn)行分離。對(duì)色譜柱施加鹽濃度從高到低的反梯度。較高的鹽濃度可增強(qiáng)樣品中疏水組分與色譜介質(zhì)間的作用。分離過程中，樣品得到純化并以較小的體積洗脫出來，從而實(shí)現(xiàn)濃縮，隨后可直接進(jìn)行凝膠過濾或者離子交換分離（經(jīng)過緩沖液交換后）。HIC 在純化方案中可用于收集、中間體純化或精制步驟。

常用純化方法對(duì)比

層析方法	親和純化色譜	離子交換色譜	凝膠過濾色譜	疏水作用色譜
分離機(jī)制	特異性	所帶電荷	分子大小	疏水性
載量	高	高	低	高
純化速度	高	高	中等	高
生物相容性	好	好	非常好	中等
目的蛋白得率	高	高	高	中等

蛋白純化中常遇問題及解決方案

問題	解決方案
純化的蛋白/抗體錯(cuò)誤	檢查DNA,確認(rèn)序列是否正確
洗脫的蛋白/抗體有污染需要提高純度	結(jié)合和洗滌條件應(yīng)更加嚴(yán)格結(jié)合和洗滌緩沖液中應(yīng)含有最高濃度可為20 mM的咪唑 色譜柱太大一減少樹脂用量 與標(biāo)簽蛋白相關(guān)的污染加入B-ME等還原劑以減少二硫鍵形成
蛋白/抗體沉淀	增加其他純化步驟,如離子交換色譜 維持低濃度(濃度<1 mg/mL) 維持充分的還原狀態(tài)(>5 mM DTT),以免氧化 維持高鹽濃度(500 mM)并加入甘油(>10%) 加入精氨酸,濃度為50 mM-500 mM 加入溫和的非變性去污劑,如0.1%6B-辛基葡糖苷
洗滌步驟中蛋白/抗體洗脫	在溫下純化 降低洗滌緩中液中咪唑濃度
蛋白/抗體洗稅不下來	降低洗滌緩沖液的嚴(yán)格度 洗脫條件可能太溫和一使用梯度pH值和洗脫緩沖液洗脫,以確定最佳洗脫條件 蛋白可能處于聚集(寡聚體/多聚俐)狀態(tài)-在變性條件下洗脫 蛋白在色譜柱中沉淀--分批結(jié)合井洗脫,以免局部蛋白濃度過高

案例展示