通過 His 標(biāo)簽純化的蛋白，雜帶比較多？

（1）如果純化的是上清，蛋白酶會(huì)部分降解目的蛋白，可通過加多種蛋白酶抑制劑改進(jìn)。
（2）可提高雜蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。
（3）雜蛋白和目的蛋白結(jié)合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

沒能純化到帶 His 標(biāo)簽的蛋白，蛋白都流穿了（未掛柱）？

（1）超聲的功率不對(duì)（太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放） ；
策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。
（2）樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確 ；
策略：檢測(cè) pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份（EDTA）。
（3）組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露 ；
策略：在變性條件下（用 8M 脲，6M 鹽酸胍，1%SDS） 并加入 1-2mMDTT 進(jìn)行純化。
（4）His 標(biāo)簽丟失；
策略 1：WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變 his-tag 的位（C-terminal orN-terminal），必要時(shí)增加 his 個(gè)數(shù)（常用 6-10 個(gè)）；
策略 2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間；
策略 3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。
Ni2+通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)（組氨酸）6 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的首選金屬離子，也是一般最常用的離子。
蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長(zhǎng)度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用 Ni2+?？梢岳?Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。

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