摘要

重組蛋白的親和純化通常是將重組蛋白克隆到含有對(duì)固定化樹脂具有高度特異性的融合蛋白或肽標(biāo)記的表達(dá)載體中。在許多情況下，融合蛋白或肽也會(huì)增加重組蛋白的溶解性，降低對(duì)宿主細(xì)菌細(xì)胞的毒性。但帶有親和標(biāo)簽的重組蛋白也面臨一些問題，比如標(biāo)簽有時(shí)會(huì)對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)甚至生物活性產(chǎn)生消極影響，這就需要對(duì)標(biāo)簽進(jìn)行去除。在通過親和力分離純化目的蛋白后，如果標(biāo)簽的存在將顯著影響其生物功能或適用該蛋白的安全性，則需要能夠移除這些標(biāo)簽，并且這一操作通常是有必要的。許多策略被設(shè)計(jì)用來在純化后去除標(biāo)簽。

在本文中，我們將總結(jié)使用親和標(biāo)記去除策略，并討論蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)的未來方向。

親和表達(dá)及酶切策略【1】

1. 融合表達(dá)一個(gè)親和標(biāo)簽及用于純化后酶切的酶切位點(diǎn)linker
2. 親和標(biāo)簽既是純化標(biāo)簽同時(shí)也促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)
3. 用于外切酶（ TAGZyme）在純化后從N端切除親和純化標(biāo)簽
4. 部分促進(jìn)可溶性表達(dá)的序列不帶有親和標(biāo)簽，例如Trx，因此需要額外加上親和標(biāo)簽

凝血酶

這種37 kDa的絲氨酸蛋白酶被廣泛使用，通過切割LVPR*GS的凝血酶識(shí)別序列，從靶蛋白中去除His-tag和其他標(biāo)簽。盡管凝血酶識(shí)別的序列是相對(duì)特異的，但有報(bào)道稱，凝血酶的商業(yè)制備會(huì)導(dǎo)致非特異性酶切。凝血酶比其他蛋白酶的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它能夠在多種表面活性劑存在下保持高活性。因此，凝血酶可用于純化膜蛋白。

TEV蛋白酶

TEV蛋白酶是在煙草蝕刻病毒中發(fā)現(xiàn)的一種酶的27kDa的C端催化亞單位。它對(duì)序列ENLYFQ*S.具有高度特異性。最初發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，該蛋白酶會(huì)自我消化。然而，通過對(duì)其進(jìn)行各種突變修改，已可以作為去除標(biāo)簽的工具。研究發(fā)現(xiàn)，S219V突變使其蛋白水解酶活性增加了至少兩倍，同時(shí)也降低了自身降解的敏感性。此外，缺乏C端238-242殘基的蛋白酶變體具有更高的表達(dá)量和催化活性。TEV蛋白酶的主要缺點(diǎn)是與其他蛋白酶相比轉(zhuǎn)化率較低。其較低的轉(zhuǎn)化率可能解釋了其對(duì)識(shí)別序列的高度特異性，但導(dǎo)致消化時(shí)間長(zhǎng)和消化所需的蛋白酶量較高。然而一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，識(shí)別序列中的絲氨酸可以轉(zhuǎn)變成蛋氨酸，在酶切后能產(chǎn)生一個(gè)“天然”的N末端。由于TEV蛋白酶切位點(diǎn)的廣泛性和低成本，也是大規(guī)模純化中很好的選擇。

3C蛋白酶

3C蛋白酶是一種來源于人鼻病毒的48kDa大小的重組半胱氨酸蛋白酶。與TEV蛋白酶一樣，它對(duì)其識(shí)別序列LEVLFQ*GP具有高度特異性。3C蛋白酶也被設(shè)計(jì)成含有一個(gè)親和標(biāo)簽，它有助于在裂解后將其從純化蛋白溶液中去除。主要缺點(diǎn)是酶切后不能目的蛋白不能形成天然N末端。另一方面，與TEV蛋白酶相比，3C蛋白酶在4攝氏度下有10倍以上的活性。

內(nèi)蛋白介導(dǎo)的自剪切

內(nèi)蛋白在細(xì)菌和酵母菌中發(fā)現(xiàn)的能夠自我切除的蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)被改進(jìn)成為能夠在N末端或C末端進(jìn)行剪切以達(dá)到目的蛋白標(biāo)簽去除的目的。例如來自結(jié)核分枝桿菌的微小內(nèi)肽蛋白I-CM突變體已被設(shè)計(jì)成有利于C末端剪切。當(dāng)pH值變成6時(shí)，C端到I-CM蛋白的序列將被剪切。如果將一個(gè)親和標(biāo)簽融合在內(nèi)蛋白的N端，目的蛋白在C端，則可在一定條件下實(shí)現(xiàn)無標(biāo)簽蛋白的純化。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是不需要使用蛋白酶來切割親和標(biāo)簽。缺點(diǎn)是必須將蛋白分成兩部分進(jìn)行純化，以便于純化后的反式剪切，并且可能留有額外的氨基酸殘基。此外在室溫下完全剪切需要比蛋白酶剪切更長(zhǎng)的時(shí)間。由于用于蛋白質(zhì)純化的內(nèi)蛋白種類繁多，目前還沒有一個(gè)可以應(yīng)用于各種不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)或通用方案。

小泛素相關(guān)修飾劑（SUMO）

用于蛋白質(zhì)純化的最常見的SUMO蛋白酶是Ulp1，一種27kDa的酵母酶，能夠?qū)UMO部分從靶蛋白中去除。與其他識(shí)別線性氨基酸序列的蛋白酶不同，SUMO蛋白酶識(shí)別其底物的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此具有高度特異性。SUMO底物是一個(gè)通常在目的蛋白N端加入的用于提高其溶解性和表達(dá)的10kDa的蛋白，與MBP水平相當(dāng)。與其他蛋白酶相比，它的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是在2M尿素和高鹽濃度的條件下依然具有較高的酶切活性。SUMO純化系統(tǒng)是一個(gè)具有高溶解性、高位點(diǎn)酶切特異性、能產(chǎn)生天然N末端等優(yōu)勢(shì)的可靠的蛋白質(zhì)表達(dá)與純化平臺(tái)。但缺點(diǎn)是成本相對(duì)較高。

結(jié)論

回顧過去幾十年為表達(dá)和純化重組蛋白而開發(fā)的親和標(biāo)簽的發(fā)展趨勢(shì)，為了提高純化效率，已經(jīng)向使用IMAC進(jìn)行了重大轉(zhuǎn)移。從2000年起，由于免疫親和樹脂的持續(xù)高成本以及其他純化系統(tǒng)的改進(jìn)，使用表位標(biāo)簽的研究已經(jīng)大幅減少。但在需要載體蛋白促進(jìn)適當(dāng)折疊、增加溶解性和提高表達(dá)水平的應(yīng)用中，這些標(biāo)簽的使用仍然是有價(jià)值的，有時(shí)是必要的?？紤]到這一需要，在選擇蛋白質(zhì)純化的親和標(biāo)簽和去除標(biāo)簽的工具方面有了許多不同的方法。在過去15年中，載體蛋白與高親和力結(jié)合的IMAC標(biāo)簽的結(jié)合使用有了越來越多的趨勢(shì)。未來的趨勢(shì)是使用與高可溶性載體蛋白的N端融合的小分子的親和力標(biāo)簽，促進(jìn)目的蛋白的折疊、溶解、表達(dá)和純化，并進(jìn)行柱上的純化及酶切位點(diǎn)的去除。

參考文獻(xiàn)

【1】C.Amarasinghe, J.P. Jin, The Use of Affinity Tags to Overcome Obstacles inRecombinant Protein Expression and Purification, Protein Peptide Lett, 22(2015) 885-892.
【2】J. Arnau, C. Lauritzen, G.E. Petersen, J. Pedersen,Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for thepurification of recombinant proteins, Protein Expres Purif, 48 (2006) 1-13.