概述

制備出效價高，特異性強，穩(wěn)定性好的抗體是免疫學實驗取得成功的基礎，抗體質(zhì)量的好壞直接影響著研究者研究的成敗，不同的免疫學實驗方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）對抗體的效價，濃度和純度有不同的要求。我們知道，一般免疫血清中含有特異性抗體和非特異性抗體，血清蛋白以及其他各種雜蛋白等，在制備特異性抗體過程中當抗體的效價達到實驗預期之后，我們所制備的抗體的純度關鍵取決于所選擇的純化方法。下面就一一介紹常用抗體純化方法及其相關原理。


免疫球蛋白主要有5種，輕鏈和重鏈的組成也有較大差異。其結構如下圖所示：


各類免疫球蛋白有不同的亞型，下圖展示人免疫球蛋白各亞型的理化性質(zhì)：

沉淀法

硫酸銨/辛酸沉淀法是純化抗體最傳統(tǒng)的方法之一，被廣泛用于血清和腹水抗體的濃縮和粗純，此方法可大規(guī)模粗純抗體，但純化后純度不高，還需配合其它方法繼續(xù)純化。
通常是將飽和硫酸加入血清或腹水中，將抗體沉淀下來，然后在溶解沉淀繼續(xù)下一步的純化。
辛酸沉淀抗體通常要先將腹水或血清的pH調(diào)至4.8，然后緩慢的滴加辛酸，是蛋白沉淀，抗體在上清中，上清繼續(xù)下一步的純化。

離子交換層析

離子交換層析也常用于抗體的純化，通量大，工業(yè)上用離子交換層析成本低，主要用于除去非抗體蛋白，及用親和層析純化時混入的Protein A/G等親和填料脫離的配基，內(nèi)毒素的去除等。
離子交換純化時，根據(jù)抗體的pI選擇合適的離子交換類型，在pI未知時可以分別用陰陽離子交換填料去試驗。
會用到的離子交換填料有：
DEAE/Q/CM/SP/MMA/MMC Focurose 6FF
MMA/MMC Focurose 6FF被廣泛用于聚體和單體及內(nèi)毒素的去除，MMA/MMC是復合型離子交換填料，層析過程洗脫時通常要用改變pH的方式洗脫。

Protein A/G親和層析

Protein A/G親和層析為從血清，腹水，細胞培養(yǎng)液中純化單克隆抗體最快捷的方法，一步層析后純度可以達到95%左右，不同來源不同亞型的抗體和Protein A/G的親和力不同。protein A和proteiin G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結合。Protein A和proteinG 作為配基可以被偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，當抗血清從中流過時，特異性的IgG就與配基結合，其他雜蛋白則穿流而過。因兩種蛋白純化抗體時對不同宿主的抗體的結合能力不同，我們需要具體情況具體對待，分別選擇protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G組合。一般推薦小鼠單抗IgG2a,IgG2b,IgG3，兔，人，豬的多克隆抗體用protein A純化，而小鼠單抗IgG1, 大鼠單抗，小鼠，大鼠，山羊的多克隆抗體則選擇用protein G純化。

Protein G與Protein A均可結合抗體的Fc段，不同的是，Protein G還能結合Fab段，且Protein G可以更廣泛的結合更多類型的IgG分子，多克隆IgG分子，同時Protein G與血清蛋白結合水平低，產(chǎn)物純度高，且配基脫落更低。

種類	亞類	Protein A	Protein G
人	IgA	可變	-
	IgD	-	-
	IgE	-	-
	IgG1	++++	++++
	IgG2	++++	++++
	IgG3	-	++++
	IgG4	++++	++++
	IgM	可變	-
豚鼠	IgG1	++++	++
	IgG2	++++	++
倉鼠	/	+	++
小鼠	IgG1	+	++++
	IgG2a	++++	++++
	IgG2b	+++	+++
	IgG3	++	+++
	IgM	可變	-
大鼠	IgG1	-	+
	IgG2a	-	++++
	IgG2b	-	++
	IgG3	+	++
兔	/	++++	+++
禽蛋黃	IgY	-	-
狗	/	++	+
豬	/	+++	+++
馬	/	++	++++
牛	/	++	++++
綿羊	/	-/+	++
山羊	/	-	++
猴子	/	++++	++++
駱駝	/	-	+
熊	/	-	+
“-”：不結合 “+”：弱結合 “++”：結合 “+++”：中等結合 “++++”：強結合

表：Protein A和 Protein G與不同種屬IgG的結合強度