離子交換層析

離子交換層析應(yīng)用最為廣泛，目標(biāo)物質(zhì)和帶相反電荷的介質(zhì)以靜電力的作用結(jié)合，然后在用高離子或改變pH的方式進(jìn)行洗脫。
特別要注意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的凈電荷，然而離子交換層析時(shí)是蛋白的局部電荷和介質(zhì)作用，另外離子交換介質(zhì)吸附的一類物質(zhì)，如陽離子交換介質(zhì)吸附帶正電荷的物質(zhì)，所以在純化過程中，需要配合層析過程進(jìn)來合理的結(jié)合及洗脫過程，才能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果（原理見圖）。

陽離子交換是另一個(gè)較常用的抗體捕獲方法。至少有4個(gè)（Humira、Synagis、Soliris、Zenapax）在歐美上市的治療性抗體藥物采用了這種捕獲方法，另外多個(gè)處于臨床階段的抗體品種也采用了陽離子交換捕獲方法。

陽離子交換與ProteinA相比的最大優(yōu)勢(shì)是成本。離子交換介質(zhì)價(jià)格僅為ProteinA的1/10，可重復(fù)使用百次以上，并耐受強(qiáng)堿清洗。另外，陽離子交換介質(zhì)的抗體載量可達(dá)100g/L，是ProteinA的2-5倍，可降低介質(zhì)使用量。

Arunakumari等開發(fā)了一個(gè)基于陽離子交換抗體捕獲、陰離子交換精純的兩步抗體分離方法。在大大降低純化成本，縮短純化時(shí)間的同時(shí)，陽離子交換層析捕獲收率達(dá)到82%，捕獲后抗體純度超過97%，作者顯示此工藝可成功放大1000倍。

陽離子交換與ProteinA相比有兩個(gè)劣勢(shì)，一個(gè)是特異性差，另一個(gè)是通用性差，需針對(duì)不同抗體和抗體表達(dá)工藝進(jìn)行優(yōu)化，如不同抗體的等電點(diǎn)不同。即使是同一抗體，不同的翻譯后修飾也造成不同的等電點(diǎn)，這些都影響到陽離子交換緩沖液pH的選擇。

捕獲后的抗體需進(jìn)一步去除宿主細(xì)胞蛋白、宿主細(xì)胞核酸、抗體聚集體、抗體片段和脫落ProteinA，以達(dá)到對(duì)患者安全的純度。精純一般采用兩步層析以保持足夠的純化冗余，但采用一步精純的工藝也越來越多。

精純步驟常用的方法包括陰離子交換層析、陽離子交換層析、疏水作用層析、羥基磷灰石層析和分子篩，其中陰離子交換和疏水作用采用流穿模式，陽離子交換和羥基憐灰石采用結(jié)合-洗脫模式。各個(gè)層析步驟的主要雜質(zhì)去除能力見表。

兩步精純工藝一般會(huì)選擇一個(gè)流穿模式，一個(gè)結(jié)合-洗脫模式，而單一步驟精純一般會(huì)選擇流穿模式（因?yàn)椴东@步驟為結(jié)合-洗脫模式）。精純介質(zhì)通常采用高效介質(zhì)（直徑10-30um）以提髙分離的分辨率，同時(shí)提髙抗體的回收率。但采用小粒徑介質(zhì)同時(shí)也限制了流速，延長(zhǎng)了純化時(shí)間。

離子交換是最常見的精純步驟。經(jīng)典的抗體純化步驟采用流穿的陰離子交換和結(jié)合-洗脫的陽離子交換兩步精純。陰離子交換對(duì)宿主細(xì)胞核酸和宿主細(xì)胞蛋白有很好的清除作用，而陽離子交換是去除多聚體和抗體片段的有效步驟。離子交換依靠抗體和雜質(zhì)表面所帶電荷差異將其分離。

抗體的電荷來自多個(gè)組成部分。賴氨酸、精氨酸、組氨酸可帶負(fù)電荷，天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可帶正電荷，N-端的氨基可帶正電荷，C-端的竣基可帶負(fù)電荷，糖基化上唾液酸可帶負(fù)電荷。

抗體上的凈電荷取決于抗體的等電點(diǎn)和緩沖液的pH，當(dāng)緩沖液pH低于等電點(diǎn)時(shí)，抗體帶正電荷；當(dāng)pH高于等電點(diǎn)時(shí)，抗體帶負(fù)電荷。所以，通過調(diào)整緩沖液的pH，可以改變其在離子交換介質(zhì)上的結(jié)合和流穿。需要指出的是，雖然一半以上氨基酸本身不帶電荷，但它們會(huì)通過結(jié)構(gòu)影響抗體的表面電荷，也會(huì)影響鄰近酸性或堿性氨基酸的電荷。

陰離子和陽離子交換的區(qū)分在于介質(zhì)上的活性基團(tuán)，陰離子交換介質(zhì)上的活性基團(tuán)為陽性（帶正電荷），可吸附流動(dòng)相中的陰性離子，陽離子交換介質(zhì)上的活性基團(tuán)為陰性（帶負(fù)電荷），可吸附流動(dòng)相中的陽性離子?；钚曰鶊F(tuán)還可進(jìn)一步分為強(qiáng)活性基團(tuán)和弱活性基團(tuán)，區(qū)分的標(biāo)準(zhǔn)是活性基團(tuán)上所帶電荷是恒定的還是隨pH改變的?？贵w純化使用的一般為強(qiáng)活性介質(zhì)。

離子交換層析首先要平衡介質(zhì)

在介質(zhì)上加載相反電荷離子，主要是鈉離子或氯離子。平衡液選擇的標(biāo)準(zhǔn)是抗體（結(jié)合-洗脫模式）或雜質(zhì)（流穿模式）易于取代平衡時(shí)加載的反荷離子吸附在介質(zhì)上，但吸附又不能太強(qiáng)或不可逆，從而易于洗脫。

第二步是樣品的加載

樣品加載時(shí)的緩沖液為低鹽溶液，以促進(jìn)抗體（結(jié)合-洗脫模式）或雜質(zhì)（流穿模式）與反荷離子交換，在介質(zhì)上的吸附。

第三步是淋洗

對(duì)于流穿模式，淋洗可采用平衡液，對(duì)于結(jié)合-流穿模式，淋洗可采用平衡液或可洗脫弱結(jié)合雜質(zhì)的緩沖液，提高洗脫抗體純化。

結(jié)合-洗脫模式的第三步是洗脫，洗脫依靠的是增加流動(dòng)相中的鹽濃度，增強(qiáng)反荷離子與抗體在介質(zhì)上的競(jìng)爭(zhēng)，從而洗脫介質(zhì)上吸附的抗體和其他物質(zhì)，洗脫下物質(zhì)的順序是從弱結(jié)合組分到強(qiáng)結(jié)合組分。

通過優(yōu)化洗脫條件，可增加抗體與雜質(zhì)在洗脫峰中分離的分辨率，從而有效去除雜蛋白、聚集體、抗體片段等雜質(zhì)。離子交換的最后一步是再生，利用高鹽緩沖液清除結(jié)合在介質(zhì)上的所有物質(zhì)，并在介質(zhì)上重新加載反荷離子，準(zhǔn)備下一個(gè)循環(huán)。

離子交換緩沖液中的緩沖體系應(yīng)該在設(shè)定pH范圍提供足夠的緩沖能力，沒有毒性，并且與抗體和介質(zhì)沒有相互作用。通常緩沖組分與介質(zhì)應(yīng)帶相同電荷，所以不會(huì)在介質(zhì)上吸附。線性洗脫可提高洗脫的分辨率，但在大規(guī)模生產(chǎn)中，為保證操作的穩(wěn)定性，一般采取階梯洗脫。

越來越多的公司開始使用一步精純來提高收率和純化速度，降低成本。Kelley等開發(fā)了一種一步精純的弱分離陰離子交換層析（WPC）方法。

弱分離陰離子交換層析操作條件介于流穿與結(jié)合-洗脫之間，采用比流穿操作更低的離子濃度，以提高流動(dòng)相中的雜質(zhì)與介質(zhì)的結(jié)合能力，提高了本步驟的雜質(zhì)去除能力。低離子濃度同時(shí)也增加了抗體在介質(zhì)上的吸附，造成部分抗體吸附在介質(zhì)上（大部分抗體流穿）。

這部分弱吸附上抗體可以通過一個(gè)短暫的淋洗洗脫，保證抗體收率。Kelley等顯示，ProteinA捕獲和弱分離陰離子交換組成的兩步抗體純化工藝可滿足抗體在宿主細(xì)胞蛋白、ProteinA、內(nèi)毒素和宿主核酸的清除要求。聚集體的清除較為復(fù)雜一些。

對(duì)于部分抗體品種，聚集體比單體的吸附能力強(qiáng)，聚集體可以采取WPC方法去除，但對(duì)另外一些抗體品種，單體比聚集體與陰離子交換介質(zhì)的吸附能力更強(qiáng)，這樣品種就只能通過篩選陰離子交換介質(zhì)或采用結(jié)合-洗脫陰離子交換方式去除聚集體。

在上一節(jié)介紹到，Arunakumari等在陽離子交換抗體捕獲的基礎(chǔ)上，采用一步陰離子交換精純的兩步抗體分離方法，可將宿主細(xì)胞蛋白和核酸降低到足夠低的水平。

抗體純化技術(shù)的另一個(gè)進(jìn)展是膜層析技術(shù)日益廣泛的應(yīng)用，尤其是在陰離子膜層析方面。陰離子交換層析膜與填料層析介質(zhì)使用的是同樣的活性基團(tuán)，但膜層析具有如下幾個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)。

一是速度快，膜層析通過對(duì)流方式，使雜質(zhì)能夠直接接觸到膜上所有的結(jié)合位點(diǎn)，開放式?？捉Y(jié)構(gòu)利用分子擴(kuò)散，可同時(shí)保證高流速和高載量。

二是載量高，膜層析動(dòng)態(tài)載量可高達(dá)l-10kg/L膜體積是填料層析的10-100倍。三是體積小，緩沖液用量降低。膜層析回收率可達(dá)95%-100%，在宿主細(xì)胞蛋白去除、核酸去除及病毒去除能力方面也與填料層析類似，具備替代傳統(tǒng)填料層析的優(yōu)勢(shì)。膜層析為一次性使用，在成本上比循環(huán)使用的填料高。

疏水層析

疏水層析和反相層析分離物質(zhì)的依據(jù)是一致的，利用疏水介質(zhì)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離。

該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合，而其他的雜蛋白則沒有此種性質(zhì)，利用此種性質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)初步的分離，用于鹽析之后的蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。

蛋白質(zhì)的疏水性強(qiáng)弱取決于其表面疏基團(tuán)的分布，同時(shí)與樣品緩沖液的離子強(qiáng)度，離子種類，pH，所處的溫度都有一定的關(guān)系，在進(jìn)行疏水層析時(shí)要保持恒定的溫度，且要對(duì)樣品緩沖液的離子種類及離子強(qiáng)度，pH進(jìn)行篩選對(duì)比分析。