親和層析

親和層析是利用待分離組分和其特異性配體間具有特異性親和力，從而達(dá)到分離的目的。

原理：

親和層析是基于生物分子與其它配基分子之間（如抗原與抗體，酶和底物，激素與受體，核酸中的互補(bǔ)鏈，多糖與蛋白復(fù)合體等）的親和吸附原理建立起來的。

蛋白質(zhì)與層析載體上的配體通過共價(jià)鍵、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學(xué)專一性結(jié)合形成復(fù)合物，共價(jià)鏈接在載體表面的功能團(tuán)配體上。蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)通過目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體間通過特異性親和力吸附而達(dá)到分離純化的目的，具有生物專一性的特點(diǎn)，純化效率高。

ProteinA是金黃色葡萄球菌的一種膜蛋白，具有與抗體特異性結(jié)合的能力，ProteinA親和層析柱已成為應(yīng)用廣泛的純化抗體的親和柱，可從腹水，血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白。

天然ProteinA由5個(gè)IgG結(jié)合域和其他未知功能的非Fc結(jié)合域組成，分子量42KD，天然ProteinA對IgG的親和能力很強(qiáng)，可以吸附大量IgG（見圖）。但同時(shí)，天然ProteinA的其他非結(jié)合域和非目標(biāo)蛋白結(jié)合，這樣被洗脫下來的蛋白純度不夠，會影響到后續(xù)的試驗(yàn)。

運(yùn)用基因工程技術(shù)，克隆出ProteinA的基因，并對其結(jié)構(gòu)改造，除去了一些不重要的非結(jié)合域。偶聯(lián)這種重組RroteinA的瓊脂糖凝膠柱在蛋白純化中，的確提高了產(chǎn)物的純度。一般使用具備較少B結(jié)構(gòu)域的ProteinA柱能獲得高純度的IgG，潔洗脫條件溫和，從而防止蛋白質(zhì)集聚，保護(hù)蛋白活性。

抗體純化的一個(gè)顯著特點(diǎn)是ProteinA親和層析的廣泛應(yīng)用，超過2/3上市抗體品種的生產(chǎn)使用ProteinA進(jìn)行抗體捕獲。ProteinA對抗體重鏈穩(wěn)定區(qū)Fc有很高的特異性和親和力，對抗體純化有很好的通用性。
ProteinA對IgG的高親和能一步去除培養(yǎng)上清中大部分雜質(zhì)，包括核酸、宿主細(xì)胞蛋白和可能存在的病毒，抗體純度達(dá)到95%或更高，收率近100%。ProteinA層析操作簡便，離心過濾后的細(xì)胞培養(yǎng)液可直接加載，不需經(jīng)過任何處理。
抗體加載后，先用緩沖液淋洗，去除與介質(zhì)或抗體弱結(jié)合的雜質(zhì)，然后利用強(qiáng)酸性緩沖液（pH3.0-3.5）洗脫P(yáng)roteinA上結(jié)合的抗體，再利用酸性更強(qiáng)的緩沖液（PH約2.0）去除強(qiáng)結(jié)合雜質(zhì)，進(jìn)行介質(zhì)再生。ProteinA的清洗可以使用鹽酸胍、尿素或低濃度堿液。

ProteinA親和層析還是一個(gè)有效的抗體濃縮步驟，洗脫液中的抗體濃度可達(dá)10g/L以上，大大縮小后續(xù)精純的液體處理量。
ProteinA親和層析工藝開發(fā)和優(yōu)化的重點(diǎn)是抗體載量、停留時(shí)間（流速）、淋洗和洗脫條件。Shukla等考察了14個(gè)IgG抗體的ProteinA純化，發(fā)現(xiàn)不同抗體間存在很大的差異，抗體的動態(tài)載量相差3倍（10-40g/L），洗脫需要的氫離子濃度相差一個(gè)數(shù)量級（pH3.0-4.1）。
利用相同的工藝，洗脫峰中宿主細(xì)胞蛋白濃度可以從接近完全清除到殘留21OOOppm，聚集體濃度可以從1%-20%，說明即使使用類似的平臺技術(shù)，也需對特定的抗體進(jìn)行特定的工藝開發(fā)和優(yōu)化。
ProteinA在使用過程中會發(fā)生脫落，脫落的主要原因是細(xì)胞培養(yǎng)液上清中含有蛋白水解酶，在上樣過程中會對ProteinA進(jìn)行水解。部分脫落的ProteinA與抗體結(jié)合，殘留在洗脫液中。由于ProteinA具有免疫原性，需在下游精純步驟中加以清除。
ProteinA雖然在抗體純化中被普遍接受，但改進(jìn)和尋找ProteinA替代物仍是抗體純化研究的一個(gè)重點(diǎn)。

ProteinA在擁有高特異性、高親和力和高通用性等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也具有若干顯著缺點(diǎn)，包括費(fèi)用高、載量低、線性流速有限、需低pH洗脫、ProteinA脫落等。
ProteinA親和介質(zhì)比普通純化介質(zhì)貴大約10倍，在抗體生產(chǎn)成本中所占的比重高于其他任何一個(gè)原材料?？贵w在ProteinA上的載量較低，動態(tài)載量通常在20-30g/L，造成介質(zhì)用量高，進(jìn)一步提高了使用成本。為控制生產(chǎn)成本，ProteinA通常會重復(fù)使用。
實(shí)驗(yàn)證明，利用較溫和的清洗步驟，ProteinA介質(zhì)可以重復(fù)使用高達(dá)300次。為了降低介質(zhì)成本，大規(guī)模抗體純化通常采用較小的ProteinA層析柱，將單批收獲液分成多批進(jìn)行ProteinA純化，減小了純化通量。ProteinA上樣是親和純化的速度限制步驟。Ghose等建議，可利用雙重上樣流速縮短上樣時(shí)間。
在上樣初期，當(dāng)抗體容易到達(dá)的結(jié)合位點(diǎn)為空時(shí)，采用高流速，等到抗體容易到達(dá)的位點(diǎn)被占領(lǐng)，抗體必須通過擴(kuò)散達(dá)到孔內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，再采用低流速，給抗體更多的擴(kuò)散時(shí)間，達(dá)到較高載量。
天然結(jié)構(gòu)ProteinA在強(qiáng)堿清洗時(shí)會降解，所有只能使用低濃度堿液（約0.lmol/LNaOH），尿素或鹽酸胍進(jìn)行清洗，但尿素和鹽酸胍廢液處理困難，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，而低濃度堿液在內(nèi)毒素清除方面的能力有限。
改構(gòu)的ProteinA，替換了ProteinA中易在堿性條件下降解（脫酰胺化）的天冬酰胺，從而使得重組ProteinA可以耐受強(qiáng)堿的清洗。

在改進(jìn)ProteinA的同時(shí)，尋找和設(shè)計(jì)可以替代ProteinA的配體也是一個(gè)重要的研究方面。具備替代ProteinA潛力的配體包括多肽、適配子、化學(xué)合成配體等，但目前這些配體在結(jié)合力、特異性和通用性等方面還不能全方位達(dá)到ProteinA水平，離商業(yè)化應(yīng)用尚有距離。在今后的5-10年里，ProteinA還將是占主導(dǎo)位置的抗體捕獲介質(zhì)。