1、PCR用引物的Tm值的計(jì)算方法?
引物為20mer以下時(shí)：
Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)
引物為20mer以上時(shí)：
Tm=81.5+0.41×(GC%)-600/L
當(dāng)中L為引物的長度。
在PCR反應(yīng)過程中選擇Annealing溫度時(shí)，一般為(Tm-5)℃。
2、設(shè)計(jì)PCR用引物時(shí)的注意事項(xiàng)?
能夠 從以下幾個(gè)方面考慮。
1.引物長度通常為20～25mer。但進(jìn)行LAPCR時(shí)，引物長度應(yīng)增長為30～35mer。
2.二條引物之間不能進(jìn)行Annealing，對3′端的3個(gè)堿基需特別注意。
3.GC含量在50～60%，避開局部富含GC或AT，為了使引物和模板穩(wěn)定結(jié)合，3′端應(yīng)避開ATrich結(jié)構(gòu)。
4.避開引物自身形成二級結(jié)構(gòu)。
5.選擇Tm溫度相互接近的二條引物。
3、PCR用引物中含有Inosine(次黃苷)堿基，其Tm值怎樣計(jì)算?
可以不考慮Inosine堿基，使用A、G、C、T計(jì)算Tm值就可以。
4、PCR用引物的使用量?
合適的終濃度可在0.1μM～1.0μM之間選擇。引物的濃度太低時(shí)，有時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物太少；引物濃度太高時(shí)，比較容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。通常模板DNA的量較多或HighcomplexityDNA(例如HumangenomeDNA)作模板時(shí)，引物濃度應(yīng)低一些；當(dāng)模板DNA的量較少或LowcomplexityDNA(例如Plasmid等)作模板時(shí)，引物濃度應(yīng)高一些。
5、簡并性引物對PCR擴(kuò)增有無影響?
有影響。簡并數(shù)量應(yīng)盡量少。
通常一條引物中簡并的堿基不要超過4處，如果簡并的堿基數(shù)過多，則會造成反應(yīng)體系中有效引物的量相對減少，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加引物的使用量。但引物量過大，容易引起非特異擴(kuò)增，應(yīng)加以注意。
6、50μlPCR反應(yīng)體系中Template的加入量?
50μlPCR反應(yīng)體系中模板DNA推薦使用量：
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人基因組DNA |
0.1μg~1μg |
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大腸桿菌基因組DNA |
10ng~100ng |
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λDNA |
0.5ng~5ng |
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質(zhì)粒DNA |
0.1ng~10mg |
7、PCR產(chǎn)物(3‘端附有A堿基時(shí))經(jīng)末端平滑后，克隆于去磷酸的平滑末端載體時(shí)，其PCR產(chǎn)物需不需要5′末端磷酸化?
需要。一般的PCR用引物5′末端都不帶磷(除非在引物合成時(shí)已特別標(biāo)記)。使用這種引物進(jìn)行PCR的PCR產(chǎn)物經(jīng)末端平滑化后，與去磷酸的平滑末端載體連接之前，PCR產(chǎn)物必須進(jìn)行5′末端磷酸化。
8、PCR產(chǎn)物需用限制酶進(jìn)行消化時(shí)，需不需要進(jìn)行Buffer交換?
在通常情況下，首先須把PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后再進(jìn)行限制酶的酶切反應(yīng)。但如果只使用PCR反應(yīng)液的一部分(1～5μl)進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，能夠 不經(jīng)純化使用限制酶進(jìn)行20μl體系的酶切反應(yīng)。
