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克隆PCR產(chǎn)物如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？

時(shí)間：2020-06-11 16:51 點(diǎn)擊次數(shù)：更多文章

克隆PCR產(chǎn)物如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？

A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。

B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。

例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。

C）

如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。

D）

用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑,沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。