免疫共沉淀（CoIP）作為一種研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于信號(hào)通路或生物學(xué)功能和機(jī)制的研究中。主要包括兩個(gè)步驟：一、利用Protein A和Protein G對抗體的特異性親和作用將抗體捕獲。二、利用抗體對抗原的特異性結(jié)合將目標(biāo)蛋白及其相互作用的蛋白一起捕獲。本期將從抗體捕獲的角度來看Protein A和G在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。

Protein A和G的各自特征

Protein A

Protein A是金黃色葡萄球菌的表面蛋白，有5個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)對IgG的Fc 片段具有很強(qiáng)的特異性親和力，一個(gè)Protein A分子至少可以結(jié)合兩個(gè)IgG分子。同時(shí)，IgA/IgM/IgE也有可能結(jié)合在Protein A上。GE的Protein A Sepharose類型非常豐富：
Protein A
天然Protein A，無動(dòng)物來源組分。
r Protein A
重組Protein A ，C-端的Cysteine可以單一位點(diǎn)定向偶聯(lián)于瓊脂糖基架上，降低空間位阻，提高抗體的結(jié)合能力。
rmp Protein A
重組Protein A是多點(diǎn)結(jié)合于瓊脂糖基架上，有效減少脫落。
MabSelect SuRe
基于高流速瓊脂糖基架的超高載量并耐堿清洗的Protein A填料。
MabSelect PrismA
結(jié)合能力更強(qiáng)，可耐受1M NaOH在位清洗。

Protein G

Protein G是一種源自鏈球菌G族的細(xì)胞表面蛋白，與Protein A一樣Protein G與IgG 的Fc 區(qū)域特異性結(jié)合，不同的是Protein G還可以特異性低親和的與Fab區(qū)域結(jié)合。重組的Protein G已經(jīng)除去了與白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，減少了非特異性結(jié)合。相比于Protein A，Protein G可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合更多類型的IgG。

抗體親和力速查表

抗體捕獲實(shí)驗(yàn)常見問題及建議

實(shí)驗(yàn)背景較高，出現(xiàn)非特異性雜帶

建議一：設(shè)置陰性對照，找出非特異性條帶出現(xiàn)的原因?？梢灾苯訉⑽刺砑涌贵w的樣品與Protein A Sepharose或Protein G Sepharose混合，如果依然出現(xiàn)雜帶，則可能該雜帶是由填料的非特異性吸附導(dǎo)致。我們的標(biāo)準(zhǔn)操作流程中，建議大家添加預(yù)澄清這一步，就是為了更好的降低填料的非特異性吸附。
建議二：在清洗液中加入低濃度的非離子型去污劑，如：Triton-X-100 或 NP-40等，降低由于疏水性引起的非特異性吸附?；蛘哌m當(dāng)提高鹽濃度，以降低由靜電作用引起的非特異性吸附。
建議三：一般在實(shí)驗(yàn)步驟中會(huì)先將抗體與樣品裂解液孵育，以使抗體可以充分捕獲目的蛋白。但有時(shí)如果抗體與Protein A Sepharose或Protein G Sepharose的親和力不高時(shí)，也可以先讓抗體與beads孵育，再去捕獲目的蛋白。

抗體的重鏈和輕鏈對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾

建議一：在CoIP捕獲階段和后續(xù)WB檢測階段盡量使用不同物種來源的抗體。
建議二：利用交聯(lián)劑將抗體交聯(lián)到Protein A Sepharose或Protein G Sepharose上，使其不被洗脫，從而不會(huì)對后續(xù)結(jié)果產(chǎn)生影響。
建議三：利用預(yù)活化的基架（如NHS預(yù)活化），不需要借助Protein A或Protein G，直接將目標(biāo)抗體偶聯(lián)于基架上進(jìn)行后續(xù)目的蛋白的捕獲，同時(shí)不受抗體種屬和亞型的影響。

快速高通量操作方法

離心柱型和96孔板型

①：預(yù)裝Protein A Sepharose或Protein G Sepharose的離心小柱，因有濾膜存在，可以通過離心流穿的方式將固體與液體分開，無需用移液器吸取上清。
②：方便快捷，可以平行處理多個(gè)樣品。
③：可以搭配Protein A/G HP SpinTrap 緩沖液試劑盒使用，試劑盒內(nèi)提供了經(jīng)典和交聯(lián)兩種免疫共沉淀所需試劑。

免疫沉淀磁珠

①：借助于磁力架便可將固液分開，可有效減少操作誤差和交叉污染。
②：操作方便，并且不受樣品體積的限制。
③：由于磁珠本身帶有顏色，觀察方便。