重組蛋白純化基本原則

蛋白的分離純化是生物工程下游階段一個比較重要的部分，尤其在基因工程重組蛋白的分離純化中，上游過程的許多因素會直接影響到下游蛋白的分離，充分利用上游對下游的影響，對蛋白的純化做一個全面的考慮和整體的設(shè)計。是否帶有親和標(biāo)簽，His標(biāo)簽，GST標(biāo)簽等，不同的親和標(biāo)簽選擇不同的純化方案；可能是可溶性表達，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進行變復(fù)性，通?；钚缘鞍椎牡寐时容^低；是否對宿主細胞具有毒性，從而選擇抗毒性的表達系統(tǒng)；怎樣選擇表達系統(tǒng)，是大腸桿菌表達系統(tǒng)，酵母表達系統(tǒng)還是CHO細胞表達系統(tǒng)，不同的表達系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目標(biāo)蛋白表達的定位（胞內(nèi)、細胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋白表達的量都依賴于所選擇的表達系統(tǒng)；蛋白的化學(xué)性質(zhì)，是否容易被蛋白酶降解，是否會和一些金屬離子，化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)；蛋白的物理性質(zhì)，是否對溫度敏感等。從蛋白基因的獲取，蛋白基因的克隆，蛋白的表達，做好一個整體的規(guī)劃，將對純化工作的方便快捷高效帶來關(guān)鍵的影響。
基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記有很多，通過改變 cDNA在被表達的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸，這個加入的標(biāo)記可用來作為一個有效的純化依據(jù)。GST融合載體，蛋白A融合載體，含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）等，不同親和標(biāo)簽的蛋白有不同的純化方案。

選擇親和標(biāo)簽時需考慮的因素

親和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響，又要考慮到對標(biāo)簽與其配體親和作用的影響，以及實際的用途。
（1）親和標(biāo)簽是否會影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，大多數(shù)情況首選短的多肽標(biāo)簽，這是因為短的肽標(biāo)簽對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)影響最小，而大的親和標(biāo)簽可能限制重組蛋白的折疊，影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。
（2）親和標(biāo)簽對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，親和標(biāo)簽的加入是否會影響到目標(biāo)蛋白的正確折疊，是促進目標(biāo)蛋白的可溶性，還是容易形成包涵體，會不會造成氨基酸C和N端破壞，使目的蛋白表達不完全。
（3）親和標(biāo)簽所融合的位置，親和標(biāo)簽可以加在N端，可以加在C端，也進行串聯(lián)。多數(shù)情況下蛋白質(zhì)的N端區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能不是太重要，所以在N端進行融合標(biāo)簽的融合常常能保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。由于N端DNA序列對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯影響較大，所以標(biāo)簽加在N端對蛋白質(zhì)的表達水平影響更大，優(yōu)化標(biāo)簽的mRNA結(jié)構(gòu)可使表達水平提高?？赡苡行┑鞍准兓笮枰コH和標(biāo)簽C端融合在去除融合標(biāo)簽后在目標(biāo)蛋白的C端會有幾個氨基酸殘留，而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N端親和標(biāo)簽后得到天然的目標(biāo)蛋白。
（4）親和洗脫的條件，有些條件比較溫和，而有些條件較為劇烈，選擇的親和表達系統(tǒng)應(yīng)該不使目標(biāo)蛋白變性。

樣品的預(yù)處理

1.誘導(dǎo)方式:誘導(dǎo)方式的選擇上，為了得到正確折疊的目的蛋白，表達菌種的生長情況，菌種是否健壯，是否是單克隆菌種，菌體的濃度是否適合誘導(dǎo)，生長狀態(tài)不好的表達菌，一方面會造成目的蛋白的錯誤折疊，造成蛋白大小，形態(tài)等發(fā)生改變，另一方面會因為IPTG的加入，導(dǎo)致菌體的死亡或者降解。
低溫度誘導(dǎo)有助于蛋白二硫鍵的正確折疊，但對于高溫表達的蛋白不適合低溫狀態(tài)，溫度過高容易導(dǎo)致包涵體的形成。
2.誘導(dǎo)劑：基因的誘導(dǎo)表達基于乳糖操縱子調(diào)節(jié)機制，沒有乳糖存在的時候，阻礙物基因產(chǎn)生阻礙蛋白，阻礙蛋白和操縱子結(jié)合，抑制基因的表達；當(dāng)有乳糖存在的時候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用產(chǎn)生異半乳糖，異半乳糖和阻礙蛋白結(jié)合，解除抑制，激活基因，開始表達蛋白。誘導(dǎo)的濃度的高低對目的蛋白的表達也會有產(chǎn)生影響。BL21（DE3）, Rosetta(DE3)等大腸桿菌表達系統(tǒng)這些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌體DE3。DE3是的一種衍生λ噬菌體，帶有噬菌體21抗性區(qū)和 lacI基因，lacUV5啟動子，以及 T7 RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出。一旦形成DE3溶原狀態(tài)，就只有受IPTG誘導(dǎo)的lacUV5啟動子指導(dǎo)T7 RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，在溶原培養(yǎng)體系中加入IPTG誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶生產(chǎn)，繼而質(zhì)粒上的目的DNA開始轉(zhuǎn)錄。
3.抽提方式：進行破壁之前應(yīng)該選擇合適的緩沖組分， 合適的pH 要結(jié)合酸堿溶液的滴定調(diào)節(jié)，盡量低的離子強度 ，加入一些穩(wěn)定成分穩(wěn)定成分，EDTA螯合重金屬離子，Triton X-100，NP40等表面活性劑，保護非極性表面等。
4.確定蛋白質(zhì)樣品的形態(tài)，濃度 黏度 體積。有時候得到粗蛋白的時候，會觀是否符合目的蛋白的一些性質(zhì)，確保得到是目標(biāo)蛋白。粗蛋白的形態(tài)有沒有明顯的差異，濃度是否符合純化的要求，是否有較多的干擾物質(zhì)，核酸 色素 強結(jié)合成分。
5.優(yōu)化表達條件
（1）重組蛋白不表達或者表達量低。如果重組蛋白不表達（包含體和可溶蛋白都沒有）通過改變誘導(dǎo)劑濃度，誘導(dǎo)溫度，時間等都不表達的時候，然后嘗試更換菌株、質(zhì)粒載體。
降低誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度。重組蛋白表達得越慢，其折疊效果就越好，大腸桿菌在4℃時依然可以表達重組蛋白，而將培養(yǎng)溫度降低至25-30℃就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導(dǎo)的重組蛋白表達；
減少誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑濃度可以降低至1/10；選用Lac滲透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。這類菌株能夠使進入每個細胞的誘導(dǎo)劑濃度相同。重組蛋白在所有細胞中的表達水平相當(dāng)時，減少誘導(dǎo)劑的效果更好。
（2）檢查密碼子構(gòu)成，使其適應(yīng)宿主菌的密碼子偏好。稀有密碼子，尤其是位于重組蛋白N端的和大量集中的稀有密碼子，會降低mRNA穩(wěn)定性，顯著降低翻譯速度，引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。將這些稀有密碼子（尤其是N端?。┩蛔?yōu)樗拗髌玫拿艽a子，能夠顯著提高表達水平。改善蛋白穩(wěn)定性。能夠引起蛋白降解的因素很多，從蛋白自身性質(zhì)到宿主性質(zhì)不一而足，如果重組蛋白在表達時就被降解，表達量和穩(wěn)定性就會受到很大影響。在大腸桿菌中表達重組蛋白，需要牢記N端法則：當(dāng)N端第二個殘基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp時，重組蛋白半衰期只有2分鐘，而小側(cè)鏈的氨基酸殘基，如Ala，則可以提高蛋白穩(wěn)定性。因此在設(shè)計載體時，要特別注意第二個密碼子，避免上述殘基的出現(xiàn)。
處理高毒性蛋白：毒性極高的重組蛋白，其本底表達就會殺死原核宿主，質(zhì)粒容易丟失，使其在大腸桿菌中很難得到高表達。采用可表達T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制劑，采用含有T7溶菌酶質(zhì)粒的宿主，如pLysS，可以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長期的本底表達量，在受到IPTG誘導(dǎo)時也能較好的表達蛋白。
（3）包涵體表達：包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對混亂、沒有生物活性、變復(fù)性條件需要長時間摸索等，即使包涵體蛋白成功復(fù)性，其均一性和活性依然備受質(zhì)疑。但是包涵體表達也有其優(yōu)勢：能夠很輕松的獲得超高的表達量，不可溶的重組蛋白不會被宿主內(nèi)的蛋白酶降解，重組蛋白的毒性被大大抑制，雜蛋白含量低（~10%），容易純化等。由于這些優(yōu)點以及蛋白質(zhì)復(fù)性條件的不斷發(fā)展，表達包涵體蛋白逐漸為人們所接受，成為重組蛋白表達的一個常用方案。與可溶蛋白相反，提高培養(yǎng)溫度、延長培養(yǎng)時間、在較高的菌密度下誘導(dǎo)都有利于包涵體的形成；在破菌和變性溶解時加入還原劑能夠打開錯配的二硫鍵；在復(fù)性液中加入二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶、分子伴侶和蛋白的輔助因子可以幫助重組蛋白折疊；精氨酸和高分子量PEG能減輕蛋白分子的聚集；嘗試多種物理手段，如透析、快速稀釋和柱上復(fù)性等，有時對復(fù)性有奇效。包涵體的表達相對簡單，但其復(fù)性過程仍是依賴經(jīng)驗的，沒有通用的方法可以套用。

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