蛋白制備及純化過程中緩沖液的選擇非常重要，合適緩沖液才能保證蛋白的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

概述

當(dāng)我們純化蛋白時(shí)，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能失活，或者是盡量降低純化過程對蛋白活性帶來的損失。這就意味著蛋白在整個(gè)純化過程中要始終保持可溶性和活性。
因此設(shè)計(jì)一個(gè)防止蛋白降解和聚合的蛋白純化緩沖體系就非常重要了，尤其會(huì)凸顯在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上。在設(shè)計(jì)緩沖buffer時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：pH值、緩沖體系、鹽離子、還原劑和穩(wěn)定劑。其中每一個(gè)因素都要根據(jù)你的目的蛋白進(jìn)行優(yōu)化，并以目的蛋白的活性作為優(yōu)化的評估標(biāo)準(zhǔn)。

一、pH

很多實(shí)驗(yàn)的pH值設(shè)定在 7.4以模仿生物條件。假如你的蛋白在這個(gè)pH值下是穩(wěn)定的，那就非常棒了！如果不是，就需要改變pH值找到目的蛋白在溶液中處于可溶性且不會(huì)降解的狀態(tài)。
一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則是：蛋白在它等電點(diǎn)pI附近的pH值溶液中會(huì)表現(xiàn)得不易溶解，因?yàn)榈鞍自谄涞入婞c(diǎn)的pH值溶液中表面沒有凈電荷，從而容易聚集。這里推薦用Expasy的ProtParam工具快速簡便地計(jì)算蛋白等電點(diǎn)pI值，只要提交蛋白序列即可。

二、緩沖體系

一旦確定了緩沖液的pH值，就需要選擇使用什么樣的緩沖體系。首先是在選擇緩沖體系時(shí)要確保選擇的緩沖體系在你設(shè)定的pH值上確實(shí)具有緩沖能力。選擇的緩沖體系，其解離常數(shù)pKa值應(yīng)該在設(shè)定的pH上下一個(gè)pH值單位內(nèi)。
再者是確保你使用的緩沖液濃度足夠高以達(dá)到實(shí)際緩沖溶液的作用，正常一般選擇的濃度是20~100mM。需要記住的是你所使用的緩沖體系不應(yīng)該影響蛋白活性！例如，磷酸鹽會(huì)抑制激酶的活性，所以反應(yīng)前應(yīng)徹底地透析掉。
此外，一些緩沖體系對溫度非常敏感，例如Tris-HCl緩沖液，如果你在25℃時(shí)將緩沖體系調(diào)至pH值8，pH值將在5℃時(shí)增加到8.58而在37℃時(shí)降到7.71。所以，如果打算在4℃條件下保存蛋白或在37℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，就應(yīng)該考慮到室溫下調(diào)的pH值可能在實(shí)驗(yàn)條件中就不適用了。

三、鹽離子

許多緩沖液中含有NaCl，以幫助保持蛋白的可溶性和模擬生理?xiàng)l件。一般常用150 mM的NaCl。
在不同的蛋白純化步驟中，可能需要改變鹽離子的濃度。例如，如果是通過離子交換層析進(jìn)行蛋白純化，一開始需要降低鹽離子的濃度（5~25mM）避免高離子強(qiáng)度和蛋白競爭和填料結(jié)合，這樣可防止蛋白從離子交換柱中流穿，從而使柱子能夠結(jié)合目的蛋白，洗脫除去雜蛋白。
其他類型的色譜分離柱，如凝膠過濾柱和Ni2+ 親和層析柱，可能需要更高的鹽濃度。我一般用高達(dá)500 mM NaCl進(jìn)行高鹽淋洗，以防止蛋白和柱之間的非特異性結(jié)合。最后通過匯瓊凝G25凝膠柱將目的蛋白置換到一個(gè)新緩沖鹽濃度的體系中。

四、還原劑

如果你的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基間的氧化可能會(huì)成為一個(gè)trouble，并可能導(dǎo)致蛋白聚集。為了防止這一點(diǎn)，往往會(huì)在緩沖液中添加一些還原劑，如DTT，TCEP或者巰基乙醇。
總的來說，TCEP是這三個(gè)還原劑中最穩(wěn)定的，但它也是最昂貴的。我通常在純化過程的緩沖液中添加DTT，在最后保存酶液的緩沖液中添加TCEP。一般比較合理的還原劑濃度是5~10mM?；旧夏阋_保還原劑濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于你的蛋白濃度。因?yàn)镈TT和巰基乙醇在室溫下就會(huì)降解，所以需要將添加了還原劑的緩沖液處于低溫保藏，或者在使用時(shí)再添加還原劑。
使用時(shí)確保柱材料能夠與這些還原劑相容。例如，高濃度的還原劑會(huì)脫掉鎳柱中的鎳，并使柱子顏色變深呈棕色（這個(gè)時(shí)候就可以考慮武漢匯研生物科技股份有限公司（www.huiyan-bio.com）的高耐受鎳柱 匯瓊親 Ni-6FF(TED)，匯研TED鎳柱可以耐受10mM的還原劑和100mM的EDTA），雖然柱子很容易進(jìn)行再生，但你的蛋白掛載量將會(huì)受到很大影響。許多柱材料都會(huì)列出其所能夠承受還原劑的最大濃度，但是我覺得或多或少都會(huì)產(chǎn)生影響，并不在于是否達(dá)到最大濃度值。

五、穩(wěn)定劑

最后，可以通過添加一些穩(wěn)定劑到蛋白純化緩沖液中，以幫助提高蛋白純化時(shí)的溶解度和穩(wěn)定性。在緩沖液中添加惰性蛋白BSA某種程度可以穩(wěn)定蛋白，但必須確保這些加入的穩(wěn)定蛋白不干擾實(shí)驗(yàn)。有時(shí)添加甘油、聚乙二醇等添加劑可以增加緩沖液粘度，有助于防止蛋白聚集。另外，使用少量的表面活性劑和一些離子化合物如硫酸鹽、氨基酸、檸檬酸等可以屏蔽蛋白間的離子相互作用，幫助蛋白溶解。
通過調(diào)整蛋白純化緩沖液的pH、緩沖體系、鹽離子、還原劑和穩(wěn)定劑，可以建立一個(gè)完善的蛋白純化緩沖體系，可以保持蛋白在純化過程中的活性和穩(wěn)定性！這一生產(chǎn)調(diào)整非常有利于蛋白產(chǎn)品、酶制劑產(chǎn)品以及抗體藥物產(chǎn)品分離純化后處理的生產(chǎn)工藝開發(fā)！

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