純化的另一個(gè)重要目的是有效去除滅活收料液中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒，以及未檢測(cè)到的外源病毒。

病毒如何去除與滅活

抗體生產(chǎn)常用的CHO和NS0細(xì)胞系都分泌內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒。這些顆粒不具備感染能力，但為了安全，需加以清除。

在細(xì)胞培養(yǎng)中，環(huán)境或原材料中夾雜的外源病毒有可能感染并利用細(xì)胞大量復(fù)制。外源病毒感染有可能通過在線或離線檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，及時(shí)終止生產(chǎn)，阻斷傳播。但病毒感染也有可能不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，造成病毒隨抗體藥物進(jìn)人下游環(huán)節(jié)。

需要指出的是，雖然存在這種間接感染的可能性，到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)任何通過使用抗體藥物感染病毒的案例。

控制病毒風(fēng)險(xiǎn)需要從三方面入手：

1、控制原材料和工藝，減少病毒污染；

2、利用原材料和中間產(chǎn)品檢測(cè)及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染；

3、在純化步驟中建立足夠的病毒滅活去除能力，清除未發(fā)現(xiàn)的病毒。

抗體純化中的各層析步驟都有不同程度的病毒滅活去除能力，尤其是陰離子交換。在陰離子交換中性上樣條件下，病毒帶負(fù)電荷，會(huì)吸附在陰離子交換介質(zhì)上，而抗體則帶正電荷流穿。蛋白A親和層析和深層過濾也有很強(qiáng)的病毒去除能力。

Zhou等發(fā)現(xiàn)，常用的深層過濾器對(duì)4種測(cè)試的模型病毒都有顯著的去除作用，其中對(duì)鼠細(xì)小病毒的去除能力超過4Log1010。在純化步驟本身的病毒去除能力基礎(chǔ)上，抗體純化還包括兩個(gè)正交的專屬病毒滅活去除步驟，即低pH孵育和病毒過濾。

病毒種類繁多，對(duì)病毒去除滅活的敏感度不同，需使用具有廣泛代表性的病毒作為模型病毒加以研究和驗(yàn)證。Miesegaes等分析了提交到美國(guó)FDA的抗體藥物申報(bào)材料，發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)小病毒和皰疹病毒是病毒去除滅活驗(yàn)證最常使用的模型病毒。

3種病毒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疼病毒為包膜病毒，體積大，理化抗性低。細(xì)小病毒則是無包膜病毒，體積小，理化抗性高。逆轉(zhuǎn)錄病毒中又以鼠白血病病毒最為常用，細(xì)小病毒中又以鼠細(xì)小病毒最為常用。采用鼠白血病病毒的原因是用于模擬宿主細(xì)胞自身表達(dá)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒。鼠細(xì)小病毒可以感染抗體生產(chǎn)用的主要宿主細(xì)胞，且體積小、理化抗性高，用來模擬難以去除的外源病毒。

ICHQ5A要求至少使用三種病毒進(jìn)行病毒去除驗(yàn)證；而實(shí)際上一般會(huì)采用四種病毒進(jìn)行病毒去除驗(yàn)證。MVM、MuLv、PRV以及Reo-3是目前CHO體系病毒去除驗(yàn)證較為使用較多的病毒（見下表）。

Miesegaes等的總結(jié)數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒，蛋白A親和、陽(yáng)離子交換、陰離子交換、低pH孵育、50nm病毒過濾和20mn病毒過濾等純化步驟都有較好的去除或滅活能力。

除陽(yáng)離子交換層析清除逆轉(zhuǎn)錄病毒效率稍低（>3Log10）外，其他各步驟的平均清除能力都超過4Log10。對(duì)于體積小、理化抗性高的細(xì)小病毒，低pH孵育、蛋白A層析、陽(yáng)離子層析則沒有顯著的去除滅活效果，僅陰離子交換和20nm病毒過濾的去除能力超過4Log10。

低pH孵育是專屬的病毒滅活步驟，對(duì)包膜病毒有極強(qiáng)的滅活作用。低pH造成病毒包膜上的蛋白結(jié)構(gòu)、膜結(jié)構(gòu)、衣殼結(jié)構(gòu)變化，從而去除病毒的傳染能力。低pH孵育步驟可以方便地置于ProteinA層析后，在低pH洗脫液的基礎(chǔ)上，調(diào)整pH，進(jìn)行0.5-2小時(shí)的孵育。

Brorson等系統(tǒng)研究了pH、時(shí)間、溫度、抗體濃度，緩沖液滲透壓，宿主細(xì)胞雜質(zhì)，抗體聚集在低pH孵育中對(duì)鼠白血病病毒的滅活作用，發(fā)現(xiàn)在很寬的操作條件下，低pH孵育能可靠地實(shí)現(xiàn)超過4-6Log10的滴度（見下圖）。

需要指出的是，低pH對(duì)抗體有多種不利影響，包括促進(jìn)抗體聚集、斷裂、加速脫酰胺化等，所有在確定孵育pH、孵育時(shí)間等參數(shù)上，需要平衡考慮對(duì)病毒滅活和抗體質(zhì)量的影響。

低pH孵育完成后，利用Tris等弱堿溶液進(jìn)行中和。在中和過程中常會(huì)伴有沉淀產(chǎn)生，這些沉淀主要是宿主細(xì)胞蛋白和核酸等雜質(zhì)，可通過深層過濾去除。增大細(xì)胞分離步驟使用的深層過濾面積可以減輕pH中和步驟沉淀產(chǎn)生。低pH孵育對(duì)鼠細(xì)小病毒等無包膜病毒沒有明顯的滅活效果。


國(guó)內(nèi)IND申報(bào)時(shí)，一般選擇低pH和膜過濾這兩個(gè)工藝。國(guó)外進(jìn)行申報(bào)時(shí)，除了選擇低pH和膜過濾，還需進(jìn)行層析工藝。

層析法最常用的是親和層析和離子交換層析。層析法是目前常用的樣品不同組分分離技術(shù)，利用各組分與固定相親和力的差異或相互作用不同的原理，實(shí)現(xiàn)病毒與樣品分離的目的。國(guó)內(nèi)的指導(dǎo)原則雖然沒有硬性的規(guī)定，但通常需要做三個(gè)批次。

在國(guó)外的指導(dǎo)原則中，明確指出至少分別做兩次獨(dú)立的研究來證實(shí)清除的可重復(fù)性，因此一般是一批樣品重復(fù)兩次（見下表）。

病毒過濾是另一個(gè)專屬的病毒去除步驟，通過納米級(jí)的孔徑截獲抗體中的病毒。病毒過濾受工藝本身變化的影響很小，是可靠的病毒去除步驟。

在抗體純化工藝中，小孔徑（去除20mn及以上病毒的細(xì)小病毒）濾器的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過大孔徑（去除50mn及以上的逆轉(zhuǎn)錄病毒）濾器。這主要是因?yàn)榈蚿H孵育對(duì)細(xì)小病毒無去除滅活作用，需要20mn濾器作為有效的小粒徑病毒去除步驟。

Miesegaes等的總結(jié)說明，50mn濾器的鼠細(xì)小病毒的平均去除效果在2Log10左右，而20nm濾芯的去除能力能達(dá)到4Log10以上。

病毒過濾主要采用死端過濾。死端過濾操作簡(jiǎn)單，而切向流過濾在操作復(fù)雜的同時(shí)，其剪切力有可能造成抗體聚集。病毒過濾濾器價(jià)格昂貴，單位膜面積價(jià)格是無菌濾器的10倍，所以在工藝優(yōu)化中需提高單位面積通量，以降低生產(chǎn)成本。

病毒過濾通常置于純化完成之后，減輕雜質(zhì)對(duì)濾膜的阻塞。盡管如此，病毒過濾前需要使用0.2um或0.1um的無菌濾器或深層過濾濾器進(jìn)行預(yù)過濾，進(jìn)一步去除宿主細(xì)胞雜質(zhì)和抗體聚集體。

死端病毒過濾使用空氣在上游儲(chǔ)罐保持固定壓力，壓力越高，單位體積的過濾速度和載量越高，但壓力不應(yīng)高于濾芯建議的使用壓力。

在過濾過程中，過濾速度會(huì)逐漸衰減，衰減速度直接影響到過濾的載量?？贵w濃度對(duì)過濾有直接影響，濃度增加，過濾速度降低。濃度降低，需要濾過的液體體積增加。具體最佳的抗體濃度，需要針對(duì)性地通過實(shí)驗(yàn)確定。

講一講：超濾換液

超濾膜系統(tǒng)是以超濾膜絲為過濾介質(zhì)，膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動(dòng)力的溶液分離裝置。超濾膜只允許溶液中的溶劑（如水分子）、無機(jī)鹽及小分子有機(jī)物透過，而將溶液中的懸浮物、膠體、蛋白質(zhì)和微生物等大分子物質(zhì)截留，從而達(dá)到凈化和分離的目的。

超濾在治療性蛋白以及試劑蛋白的純化過程中是比較關(guān)鍵的步驟，用于替換緩沖液和濃縮。小規(guī)模的時(shí)候，水和小分子可以通過離心或壓力的方式透過半透膜，蛋白濃度在膜表面濃度會(huì)變得很高，在抗體超濾過程中，尤其在低溫過程超濾時(shí)，易出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，而加入精氨酸可以降低聚體的形成。

治療性抗體由于需要高劑量，因此需要超濾至高濃度，高蛋白濃度會(huì)形成高粘度，而且需要更合適的處方，然而超濾過程中形成高蛋白濃度與小的親水半徑有關(guān)，甚至是2nm，在proteinA層析低pH洗脫的時(shí)候也出現(xiàn)小的水合半徑，只有溶菌酶的10倍小。這主要是由于處于低鹽或pH下，靜電作用不能完全被隔離，而在高蛋白濃度下，過量的體積占主要作用。

綜合以上所述

純化的整個(gè)層析過程：

1、平衡

使層析柱處于可使用的狀態(tài)，用于維護(hù)良好的結(jié)合條件并定義色譜曲線的基線零點(diǎn)。

2、上樣

目標(biāo)分子與介質(zhì)能夠充分，均勻有限接觸，實(shí)現(xiàn)結(jié)合的過程。上樣量，上樣流速等對(duì)分離過程都有很大影響，需要實(shí)驗(yàn)摸索最佳上樣過程。

3、洗雜

將介質(zhì)表面，孔內(nèi)，間隙殘留的未和介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)洗掉。

4、洗脫

將結(jié)合在介質(zhì)上（包括孔內(nèi)和表面）的物質(zhì)逐步洗脫下來，洗脫過程又可分多步進(jìn)行，把結(jié)合強(qiáng)弱不同的物質(zhì)分開，實(shí)現(xiàn)分離的目的。

5、維護(hù)

維護(hù)包括再生，清洗，消毒，保存。

另外抗體純化的主要任務(wù)為：

1、工藝優(yōu)化

親和工藝、精純工藝、除病毒滅活與過濾工藝；

2、小試純化

用于藥理、毒理、穩(wěn)定性等研究提供樣品；

3、

工藝放大及中試生產(chǎn)將優(yōu)化后的工藝進(jìn)行規(guī)模放大，使其適用于200L工藝，同時(shí)生產(chǎn)出用于臨床申報(bào)的產(chǎn)品；

4、文件書寫

用于臨床申報(bào)及工藝轉(zhuǎn)移的文件。

參考文獻(xiàn)：

1、Af?nity Chromatography：Methods and Protocols-Third Edition

2、Downstream industrial biotechnology-Recovery and purification

3、Ultrafiltration for Bioprocessing-Development and Implementation of Robust Processes

4、Protein Purification-Second Edition