自從抗體被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，有多種方法可以用于分離純化抗體，全球的科學(xué)家們一直在探索有效的單抗分離純化方法，以及適于抗體藥物規(guī)模生產(chǎn)的工藝。本文對(duì)已經(jīng)報(bào)道過(guò)單抗的分離純化方法做以總結(jié)，為規(guī)?；贵w藥物分離純化工藝的提供選擇策略。

1  單克隆抗體的純化工藝

單克隆抗體的分離純化工藝采用三步法純化策略：捕獲--中度純化--精純。根據(jù)捕獲所選用的層析介質(zhì)不同主要分兩種類型:
A. 使用經(jīng)典的Protein A為捕獲步驟設(shè)計(jì)的純化工藝。
B. 使用非Protein A 設(shè)計(jì)的純化工藝。
現(xiàn)在在已經(jīng)上市的抗體（包括Fc融合蛋白）藥物，兩種工藝均有采用。但是以Protein A為捕獲工藝的產(chǎn)品約占70%。使用非protein A捕獲的工藝約30%。隨著抗體項(xiàng)目不斷增多，抗體純化工藝的平臺(tái)工藝隨之出現(xiàn)?？贵w有類似的結(jié)構(gòu)，所以使用平臺(tái)工藝可以更好的了解工藝特性，產(chǎn)品質(zhì)量等特性。為GMP認(rèn)證中的工藝驗(yàn)證提供基礎(chǔ)。更快的將產(chǎn)品推向市場(chǎng)。

2. 單抗分離純化中的親和層析介

親和層析具有專一、高效的特性，使用親和層析純化后，抗體的純度一般大于95%以上，收率在95%以上；所以在抗體純化工藝中一般使用親和層析作為單抗純化工藝的捕獲步驟。在單抗分離純化中，按照不同的產(chǎn)品特性可以選擇的親和層析主要有：

A.嵌合抗體，人源化，全抗體一般使用Protein A 或Protein G層析介質(zhì)為捕獲步驟；
B FC融蛋白一般使用Protein Ａ層析介質(zhì)做捕獲步驟。
C  Fab片段，或scFv 單鏈抗體一般使用ProteinL層析介質(zhì)捕獲， Protein L (Capto L)對(duì)輕鏈kappa片段有特異吸附。如果輕鏈的種類是Lambda，可以選擇LambdaFabSelect層析介質(zhì)特異的捕獲。
D 單區(qū)域抗體sdAb一般有VH區(qū)域，也可以使用protein A，如MabSelect 作為捕獲步驟。

3. Protein A層析介質(zhì)

a Protein A 的性質(zhì)

金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal ProteinA，SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，能特異性地與人或哺乳動(dòng)物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)域結(jié)合。天然的protein A SPA由十種氨基酸組成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無(wú)二硫鍵。紫外光譜和吸收系數(shù)為A275nm和1.65，等電點(diǎn)為pH5.1。SPA十分穩(wěn)定，4mol/L尿素、硫氰酸胍、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件以及加熱煮沸均不影響其活性。分子量：全長(zhǎng)的SPA54KD，去掉與細(xì)胞壁結(jié)合部分的SPA 42KD。SPA與IgG結(jié)合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4，對(duì)IgG3沒(méi)有吸附，不同的物種有一定的差異，可以參考GE公司《AntibodyPurification Handbook》。

SPA 分子有5個(gè)區(qū)域，分為E/D/A/B/C?？贵wIgG有兩個(gè)區(qū)域與SPA結(jié)合，分別是Fc與Fab區(qū)域。主要與Fc的CH2,CH3結(jié)合的是SPA的B區(qū)域；與Fab結(jié)合位點(diǎn)是VH3，SPA的結(jié)合位點(diǎn)是D和E區(qū)域2。對(duì)于不同的抗體輕鏈，Kappa輕鏈的結(jié)合力大于Lambda輕鏈。
近幾年來(lái)基因工程的SPA出現(xiàn)，解決了天然protein A的耐堿性問(wèn)題，MabSelectSure是基因工程的SPA，去掉了天然SPA的D/A/C/E區(qū)域，對(duì)于B區(qū)域進(jìn)行了修飾，將不耐受NaOH的氨基酸去掉,或更換為耐受NaOH的氨基酸。使修飾后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH；這就很好的解決了層析介質(zhì)CIP的問(wèn)題，同時(shí)修飾后的SPA也耐受蛋白酶。使SPA的脫落更低。

b Protein A 層析介質(zhì)的來(lái)源

1. 天然Protein A：使用CNBr方法與瓊脂糖偶聯(lián)；
2. 重組protein A：大腸桿菌表達(dá)，無(wú)動(dòng)物成分來(lái)源，通過(guò)CNBr方法與瓊脂糖偶聯(lián)；
3. 重組protein A：大腸桿菌表達(dá)，通過(guò)穩(wěn)定的硫醚鍵與瓊脂糖偶聯(lián)；
4. 重組protein A,大腸桿菌表達(dá)，無(wú)動(dòng)物成分來(lái)源，通過(guò)還原的氨基與瓊脂糖偶聯(lián)，可以多點(diǎn)與IgG結(jié)合，吸附兩個(gè)IgG分子；
5. 重組protein A,大腸桿菌表達(dá)，無(wú)動(dòng)物成分來(lái)源，通過(guò)環(huán)氧鍵與高流速瓊脂糖偶聯(lián)；
6. 重組基因工程protein A,大腸桿菌表達(dá)，無(wú)動(dòng)物成分來(lái)源。耐堿Protein A。通過(guò)環(huán)氧鍵與高流速瓊脂糖偶聯(lián)。LX為高載量。

4  Protein G的性質(zhì)

Protein G是從G類Streptococci細(xì)菌中分離出來(lái)的胞壁蛋白，與多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG Fc區(qū)域結(jié)合；天然的Protein G與血漿中的白蛋白有親和力，所以通過(guò)基因工程重組的Protein G去掉了白蛋白的親和位點(diǎn)。
Protein G可以抗體的不同亞型結(jié)合，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。與Ig G的Fc結(jié)合，同時(shí)也可以結(jié)合IgGCH1區(qū)域。所以在抗體片段的純化中也可以使用Protein G純化Fab片段。
Protein GSepharose 4 Fast Flow 使用重組的protein G，大腸桿菌表達(dá)，已經(jīng)去除了白蛋白結(jié)合位點(diǎn)，此配基為 MW17KD。在全抗體或Fc融合蛋白的純化中由于Protein A 層析介質(zhì)的載量高于ProteinG，SPA的動(dòng)態(tài)載量一般為20-60g/L。Protein G的動(dòng)態(tài)載量一般為20-30g/L。所以在抗體的純化工藝中一般使用Protein A層析介質(zhì)。

5   Protein L的性質(zhì)

Protein L 是上世紀(jì)80年代從Peptostreptococcusmagnus菌中分離得到的。天然的Protein L由719個(gè)氨基酸組成，不含二硫鍵，是一個(gè)酸性的分子PI為4。與IgG的輕鏈（L鏈）結(jié)合。Protein L主要與Kappa 輕鏈有親和力。Protein L對(duì)不同的IgG，IgM，IgA，IgE以及IgD均有親和力。Protein L結(jié)合輕鏈的Kappa區(qū)域，與lambda 沒(méi)有親和作用，親和位點(diǎn)在輕鏈的I、III、IV區(qū)域。Capto L是大腸桿菌表達(dá)的基因工程Protein L為配基（分子量35KD）與Capto骨架偶聯(lián)的Bioprocess 系列親和介質(zhì)。
在人免疫球蛋白輕鏈中包含兩種亞型，Lambda和Kappa，大約60%的IgG 為kappa，40% 的IgG 含有Lambda。在建立純化方法前，最好鑒定輕鏈的類型。選擇正確層析介質(zhì)分離純化。

6 親和層析技術(shù)的分離純化策略

1 Protein A

層析介質(zhì)的發(fā)展歷史單抗作為同一類分子有其類似的分子結(jié)構(gòu)，這是使用平臺(tái)技術(shù)作為分離純化的基礎(chǔ)。例如：含有Fc片段的全抗體或Fc融合蛋白可以使用Protein Ａ層析介質(zhì)作為捕獲步驟。

單抗藥物的劑量為幾毫克-幾百毫克。由于單抗要求的劑量較大，如：Rituximab 400mg/m2，Humira 40mg/劑；所以單抗藥物的產(chǎn)品質(zhì)量要求極高。雜質(zhì)的殘留量極低，例如：HCP<100ppm，DNA<10pg/劑， Protein A<10ppm，聚體<1%。Protein A捕獲步驟主要去除的雜質(zhì)：大部分HCP，DNA；由于 ProteinA層析介質(zhì)對(duì)聚體沒(méi)有去除作用，所以在此捕獲步驟中盡量減少聚體的形成，某些Protein A層析介質(zhì)在純化中會(huì)產(chǎn)生聚體，這樣的protein

A介質(zhì)盡量避免使用。在此捕獲步驟中會(huì)有Protein A（配基）的脫落。在Protein A捕獲過(guò)程中，培養(yǎng)上清中的蛋白酶會(huì)降解層析介質(zhì)的配基Protein A，因此樣品收集液中會(huì)有Protein A的片段；以及ProteinA與介質(zhì)骨架的偶聯(lián)方式不穩(wěn)定，這些都是protein A的脫落原因。所以選擇Protein A脫落較低的層析介質(zhì)是非常關(guān)鍵的。

2 用于捕獲抗體的Protein A層析介質(zhì)的選擇

現(xiàn)在商業(yè)化Protein A的層析介質(zhì)較多，對(duì)于不同的項(xiàng)目選擇方法如下：
A. Fc融合蛋白：一般Fc融合蛋白的DBC低于單抗。這是Fc融合蛋白的空間位阻效應(yīng)大于單抗。對(duì)于Fc融合蛋白MabSelectXtra高動(dòng)態(tài)載量的重組protein A介質(zhì)是比較好的選擇；
B. FC融合蛋白：如果Fc融合蛋白的穩(wěn)定性差，由其在低pH緩沖液中，可以選擇MabSelect Sure。由于只有FC區(qū)域的結(jié)合，所以洗脫時(shí)的所用的pH稍高；
C. 高表達(dá)量：隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，抗體的表達(dá)水平不斷提高，對(duì)于高表達(dá)量的項(xiàng)目可以選擇Mabselect Sure LX。通常的載量在60g/L以上；
D. 不同可變區(qū)的類型在Protein A層析介質(zhì)的DBC也不同，一般VH3 > VH 1>VH2>VH4；
E. 修飾后的ProteinA 如：Mabselect Sure 對(duì)Fab沒(méi)有親和作用，此類介質(zhì)不能用于抗體的結(jié)構(gòu)域VH；
F. Fab，ScFv可以按照分子的結(jié)構(gòu)中輕鏈類型選擇Capto L,或LambdaFabSelect。

7 Protein A作為抗體的工藝的捕獲選擇策略：

A.  耐堿性

藥物GMP生產(chǎn)最基本的要求是無(wú)菌、無(wú)熱源。NaOH是最好的除菌、除熱源的試劑。同時(shí)NaOH也是公認(rèn)的CIP試劑，使用NaOH可以很好的除去殘留在層析介質(zhì)上的雜質(zhì)，以確保工藝的穩(wěn)定性以及層析介質(zhì)的壽命；并且NaOH的成本低。NaOH是公認(rèn)的CIP試劑，實(shí)驗(yàn)表明，NaOH的清洗效果高于其他試劑。如圖，NaOH清洗Protein A層析介質(zhì)的效果。如下圖。 用不同CIP試劑清洗后凝膠顆粒上的殘留蛋白。SDS-PAGE（DeepPurple染色）用于評(píng)估CIP試劑的清洗效率。NaOH是一種非常高效的清洗試劑，適合瓊脂糖基架的填料。而對(duì)照的可控玻璃基架（CPG）填料的清洗結(jié)果表明，鹽酸胍比磷酸更為有效。CPG填料在高pH下不穩(wěn)定，不適合用NaOH清洗。
MabSelect Sure 系列是通過(guò)基因工程修飾的Protein A介質(zhì)，提高了層析介質(zhì)耐受NaOH的能力。修飾后的Protein A在洗脫時(shí)，不同的抗體洗脫pH更均一，為抗體純化的平臺(tái)工藝提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，MabSelect Sure LX是最新的Protein A層析介質(zhì)，結(jié)合了耐堿和高載量的性質(zhì)。

同時(shí)病毒的去除效率在Protein A的步驟中與層析介質(zhì)有關(guān)，隨著載量的下降以及柱壓的升高，收率的降低，證明層析介質(zhì)壽命到期，病毒的清除效率降低。

B. 動(dòng)態(tài)載量與保留時(shí)間

一般ProteinA層析介質(zhì)的理論載量為70-80g/L左右。高載量可以減少層析柱的體積。保留時(shí)間是指樣品在層析柱內(nèi)的停留時(shí)間或樣品與層析介質(zhì)的接觸時(shí)間。較低的保留時(shí)間可以使用較快的流速，從而提高生產(chǎn)效率在抗體純化工藝開(kāi)發(fā)時(shí)，動(dòng)態(tài)載量以及保留時(shí)間是一個(gè)平衡的過(guò)程，單純追求高動(dòng)態(tài)載量，可能保留時(shí)間會(huì)較長(zhǎng)，使得上樣時(shí)間延長(zhǎng)，這樣培養(yǎng)基中的蛋白酶就有時(shí)間分解樣品，以及上樣時(shí)蛋白酶降解Protein A，使Protein A的脫落增加。另外一些高載量的protein A 層析介質(zhì)，是通過(guò)提高配基密度（ProteinA）增加動(dòng)態(tài)載量的。但是配基密度提高過(guò)程中，如果配基與的層析基質(zhì)（骨架）的偶聯(lián)不穩(wěn)定，就會(huì)增加protein A的脫落。此類ProteinA介質(zhì)在初期動(dòng)態(tài)載量較高，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的使用，隨著配基的脫落，載量很快降低。

單純追求高流速，可能會(huì)使層析介質(zhì)的柱壓升高，提高了純化過(guò)程中對(duì)生產(chǎn)設(shè)備（層析柱以及層析系統(tǒng)）的要求。隨著上樣次數(shù)的增多（生產(chǎn)循環(huán)次數(shù)的增加）層析介質(zhì)的反壓增高，從而減少層析介質(zhì)的壽命。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，以硅膠基質(zhì)或CPG的層析介質(zhì)在重復(fù)裝柱的過(guò)程中易破碎，從而增加運(yùn)行的壓力以及減少介質(zhì)的使用壽命?，F(xiàn)代的Protein A的動(dòng)態(tài)載量一般在35-60g/L之間，保留時(shí)間一般在3-5min左右（20cm柱床高度，線性流速在250-400cm/h）。

隨著細(xì)胞培養(yǎng)條件的改善，抗體的表達(dá)量的提高（由原來(lái)的1-2g/L提高到5g/L以上），對(duì)于Protein Ａ層析介質(zhì)的關(guān)注從上樣的速度轉(zhuǎn)到關(guān)注上樣的載量（DBC）。事實(shí)上，現(xiàn)在普遍更關(guān)注的要點(diǎn)是DBC與上樣的速度的平衡。

C. 低配基脫落

配基脫落在單抗藥物中有嚴(yán)格的規(guī)定，在最終的藥物中protein A 的殘留<10ppm。所以Protein Ａ捕獲步驟中，選擇低protein A的脫落的層析介質(zhì)對(duì)抗體藥物質(zhì)量控制以及工藝的風(fēng)險(xiǎn)控制是非常關(guān)鍵的。

Mabselect 系列的Protein Ａ層析介質(zhì)的protein A的proteinA殘留在20ppm以下。采用環(huán)氧鍵與高流速瓊脂糖偶聯(lián)，增加了偶聯(lián)穩(wěn)定性，從而降低了Protein A的脫落。同時(shí)，配基脫落高，也會(huì)導(dǎo)致介質(zhì)的壽命縮短。層析介質(zhì)的壽命是需要幾十至上百次試驗(yàn)的結(jié)果證明，有些介質(zhì)可能在小試時(shí)30-50個(gè)循環(huán)后，載量、收率以及產(chǎn)質(zhì)量的結(jié)果可以接受，但是隨著使用次數(shù)的增加，配基脫落顯著，從而造成純度收率下降。

D. 低非特異雜質(zhì)吸附

Protein A捕獲的樣品是細(xì)胞培養(yǎng)的上清液。宿主蛋白是捕獲步驟的中主要雜質(zhì)。雖然ProteinA對(duì)抗體的Fc有特異性、專一性，但是層析介質(zhì)的基質(zhì)（骨架）有時(shí)會(huì)對(duì)雜質(zhì)有非特異吸附。有文獻(xiàn)報(bào)道以聚合物為基質(zhì)的ProteinA層析介質(zhì)非特異吸附較高，洗脫時(shí)宿主蛋白會(huì)與抗體共同洗脫。從而HCP的殘留量較高。以瓊脂糖為基質(zhì)ProteinA層析介質(zhì)非特異吸附較低，一般的洗脫收集的樣品中HCP的殘留在100-200ppm 之間10。捕獲步驟中的低HCP會(huì)減少精細(xì)純化步驟的壓力。

E. 層析介質(zhì)的工業(yè)裝柱方法

在生產(chǎn)中，層析介質(zhì)與層析柱是配合使用的；所以層析介質(zhì)的裝柱是一項(xiàng)必不可少的工作。在抗體的中試與生產(chǎn)中使用的層析柱一般直徑在300mm以上；有些劑量大的項(xiàng)目，生產(chǎn)中需要使用直徑1-1.4m的層析柱，因此，生產(chǎn)規(guī)模的層析柱--裝柱簡(jiǎn)易性是非常關(guān)鍵的。由于生產(chǎn)規(guī)模使用的層析介質(zhì)體積較大，所以在層析柱的設(shè)計(jì)時(shí)采用幾種裝柱模式：

1.采用泵將層析介質(zhì)噴入層析柱中，例如ChromaFlow；
2. 采用吸入的方式，將層析介質(zhì)吸入層析柱中，例如Axichrom。

層析柱的裝柱不只是層析柱的設(shè)計(jì)，層析介質(zhì)的裝柱方法是否適用，以及在裝柱過(guò)程中層析介質(zhì)是否易破碎也是抗體工藝選擇層析介質(zhì)關(guān)鍵的因素。例如：CPG為骨架的層析介質(zhì)在裝柱中需要不斷震蕩，以及裝柱及拆柱過(guò)程中易碎。這可能會(huì)造成生產(chǎn)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

在規(guī)?；a(chǎn)中，裝柱結(jié)果的重復(fù)性和層析柱的穩(wěn)定性也是非常關(guān)鍵的因素。在考慮層析介質(zhì)性能的同時(shí)還要考慮層析介質(zhì)是否適于GMP生產(chǎn)以及供應(yīng)商的穩(wěn)定供貨。GMP要求：
1. 層析介質(zhì)的生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有使用動(dòng)物源成分；
2. 層析介質(zhì)的穩(wěn)定性，包括不同pH下，溫度等，例如：ProteinA在低pH洗脫，層析介質(zhì)在低pH的穩(wěn)定性，配基脫落、骨架的泄露等。
3. 層析介質(zhì)的批間差異，生產(chǎn)規(guī)模的層析介質(zhì)要求批間差異小。
4.層析介質(zhì)的批量，即一批層析介質(zhì)的產(chǎn)量，一般一根層析柱裝同一批次的層析介質(zhì)用于工業(yè)生產(chǎn)。
5. 法規(guī)支持文件，完備的法規(guī)支持文件可以方便藥品報(bào)批過(guò)程中工藝驗(yàn)證。

8 總結(jié)

2012年，Oxford Analytica通過(guò)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了Mabselect Sure可以減少15%的生產(chǎn)成本。它為抗體仿制藥提供了一個(gè)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，高效的工具。提高新一代抗體的生產(chǎn)能力、在生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定性以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性是現(xiàn)代抗體工藝的研發(fā)趨勢(shì)。選擇穩(wěn)定的親和層析介質(zhì)作為起始捕獲步驟，可以得到最佳的生產(chǎn)工藝。